PCR检测技术和临床应用专家讲座

PCR检测技术及临床应用北京协和医院检验科韩建华PCR检测技术和临床应用专家讲座第1页详细内容PCR技术介绍PCR引物设计标准RT-PCR实时荧光定量PCR技术罗氏企业COBASAmplicor乙肝定量检测仪PCR检测技术和临床应用专家讲座第2页一、PCR技术介绍PCR检测技术和临床应用专家讲座第3页PCR介绍聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是1985年由K·

Mullis创建一个体外酶促扩增特异DNA片段方法。该技术在短时间内就可在体外扩增取得大量目标基因，从而比较轻易对目标基因进行分析判定，所以已被广泛应用于分子生物学各个领域。PCR检测技术和临床应用专家讲座第4页PCR技术基本原理PCR在体外酶促扩增DNA原理，类似于天然DNA复制机制，主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板特征，由变性-退火-延伸三个反应步骤完成：1.变性（denature）2.退火（annealing）3.延伸（extension）PCR检测技术和临床应用专家讲座第5页PCR检测技术和临床应用专家讲座第6页PCR原理动画演示PCR检测技术和临床应用专家讲座第7页PCR基本原理整个PCR过程普通需要进行三十轮循环。在最初循环阶段，原来DNA链起着模板作用，伴随循环次数递增，新合成引物延伸链急剧增多而成为主要模板，而且PCR扩增产物将受到所加引物5’末端限定，其终产物序列是介于两种引物5’末端之间区域。PCR检测技术和临床应用专家讲座第8页PCR基本原理理论上PCR合成产物数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n-2n指数方式递增，但因为DNA聚合酶质量、待增片段序列及反应系统条件等各种原因影响，实际扩增效率比预期要低。PCR检测技术和临床应用专家讲座第9页PCR基本原理PCR反应中，当引物-模板与DNA聚合酶到达一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，出现“平台效应”，即PCR反应产物不再增加。

这主要取决于起始模板拷贝数、所用DNA聚合酶性能及底物dNTP浓度等。PCR检测技术和临床应用专家讲座第10页标准PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR检测技术和临床应用专家讲座第11页PCR反应成份

1

TaqDNA聚合酶:是影响PCR反应主要原因，不一样PCR反应都有最适聚合酶用量。

2

引物浓度：普通为0.1-0.5μmol/L。

3

Mg2+：可影响DNA聚合酶活性，提升双链DNA解链温度，普通为1.5-2.0μmol/LPCR检测技术和临床应用专家讲座第12页PCR反应成份

4dNTP：取决于扩增片段长度、Mg2+浓度、引物浓度等反应条件，普通为50-200μmol/L。

5模板：在一定范围内PCR产量随模板浓度升高而显著升高。

6添加剂：如：二甲基亚砜等PCR检测技术和临床应用专家讲座第13页PCR反应特点1、特异性强：聚合酶合成反应忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性。2、灵敏度高：PCR产物能将皮克(pg=10-12)量级起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。3、简便、快速：一次性地将反应液加好后，普通在2～4小时即可完成扩增反应。4、对标本纯度要求低：可直接用临床标本如血液、体腔液等粗制DNA扩增检测。PCR检测技术和临床应用专家讲座第14页PCR扩增产物分析

PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格分析与判定，才能得出正确结论。PCR产物分析，可依据研究对象和目标不一样而采取不一样分析方法。PCR检测技术和临床应用专家讲座第15页PCR产物分析凝胶电泳分析酶切分析分子杂交核酸序列分析琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳Southern印迹杂交斑点杂交PCR检测技术和临床应用专家讲座第16页PCR常见问题1、假阴性，不出现扩增条带

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化洁净，尤其是染色体中组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。

酶失活：有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物浓度、两条引物浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、轻易弥散常见原因。PCR检测技术和临床应用专家讲座第17页1、假阴性、不出现条带

Mg2＋浓度：Mg2＋离子浓度对PCR扩增效率影响很大。

反应体积改变：应用多大致积进行PCR扩增，是依据科研和临床检测不一样目标而设定。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当主要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功。

PCR检测技术和临床应用专家讲座第18页2、假阳性

引物设计不适当：选择扩增序列与非目标扩增序列有同源性

靶序列或扩增产物交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段交叉污染，导致假阳性。二是空气中小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定同源性。可相互拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而造成假阳性产生。PCR检测技术和临床应用专家讲座第19页3、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现条带与预计大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2＋离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多及酶质和量等引发。PCR检测技术和临床应用专家讲座第20页4、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带，其原因往往因为酶量过多或酶质量差，dNTP浓度过高，Mg2＋浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引发。PCR检测技术和临床应用专家讲座第21页PCR产生污染原因样品交叉污染；PCR试剂污染：如加样枪、蒸馏水等产物污染：最主要是气溶胶—DNA产物溶于空气中；重组质粒污染：阳性对照；标准品等其它：培养物等PCR检测技术和临床应用专家讲座第22页污染监测

阳性对照：要选择扩增度中等、重复性好，经各种判定是该产物标本作为阳性对照。

阴性对照：它包含①标本对照②试剂对照重复性试验

选择不一样区域引物进行PCR扩增

PCR检测技术和临床应用专家讲座第23页降低污染方法试验室分区：1、样品准备区（前处理）2、试剂准备区：必须保持洁净无任何——尤其是DNA扩增产物污染3、扩增区：小心处理产物；区域内必须形成负压PCR检测技术和临床应用专家讲座第24页环境污染处理方法1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；

2.紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意是，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。PCR检测技术和临床应用专家讲座第25页PCR类型1不对称PCR2多重PCR3着色互补PCR4巢居PCR5半巢居PCR6二温式PCR7锚定PCR8反向PCR9锅柄PCR10ALU-PCR11增敏PCR12重组PCR13表示PCR14原位PCR15RNA聚合链反应16差示PCR17竞争PCRPCR检测技术和临床应用专家讲座第26页二、PCR引物设计标准PCR检测技术和临床应用专家讲座第27页怎样构建一个成功PCR反应？1、目标基因序列获取

获取目标基因序列以制备扩增引物,对于临床检测项目其目标基因序列多为已知,其可从以下资源取得:GenBankEuropeanmolecularbiologylaboratory(EMBL)

http://www.ebi.ac.ukPCR检测技术和临床应用专家讲座第28页2、引物设计与合成

引物结合位置

此是由试验目标决定a若只是检测目标序列有没有,对引物定位无严格要求b若是检测某个基因等位基因,那么扩增子(amplicon)中必须包含目标基因序列PCR检测技术和临床应用专家讲座第29页引物设计与合成

引物长度

引物特异性普通经过引物长度和退火温度来控制,引物普通长度为15-30bp,但其长度不应超出38bp,惯用是18-27bp.引物长度增加其特异性增强,但会降低反应效率PCR检测技术和临床应用专家讲座第30页引物设计与合成引物3’末端和5’末端核苷酸

a引物3’端是PCR延伸起始端,不能进行任何修饰,应防止二级结构形成;引物3’端出现3个以上连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加;且应该防止在引物3’端使用碱基A.b引物5’端仅限定PCR产物长度,他对扩增特异性影响不大,允许被修饰.PCR检测技术和临床应用专家讲座第31页引物设计与合成

引物中GC含量：普通为40%-60%.过高或过低都不利于反应.

扩增子大小：普通来讲,扩增子大小应在100-1000bp之间.

防止引物本身和引物之间互补

碱基随机分布

防止引物形成二级结构及发夹结构

PCR检测技术和临床应用专家讲座第32页PCR引物设计标准3、引物浓度4、Taq酶浓度5、Mg2+浓度6、dNTP浓度7、Tm温度：DNA模板双链充分解链是PCR成功前提,在普通情况下Tm取93℃-94℃。8、设置试验对照PCR检测技术和临床应用专家讲座第33页三、RT-PCRPCR检测技术和临床应用专家讲座第34页逆转录-聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)原理是：提取组织或细胞中总RNA，以其中mRNA作为模板，采取Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目标基因或检测基因表示。PCR检测技术和临床应用专家讲座第35页测RNA纯度PCR扩增cDNA电泳操作步骤制备cDNAPCR检测技术和临床应用专家讲座第36页预防RNA酶污染办法1、全部玻璃器皿均应在使用前于180℃高温下干烤6hr或更长时间。2、塑料器皿可用0.1%DEPC(二乙基焦磷酰胺)水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、有机玻璃电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%双氧水室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。PCR检测技术和临床应用专家讲座第37页预防RNA酶污染办法4、配制溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上,然后用高压灭菌除去残留DEPC。不能高压灭菌试剂，应该用DEPC处理过无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。

6、设置RNA操作专用试验室，全部器械等应为专用。

PCR检测技术和临床应用专家讲座第38页RT-PCR应用分析基因转录产物获取目标基因合成cDNA探针构建RNA高效转录系统

PCR检测技术和临床应用专家讲座第39页四、荧光定量PCRPCR检测技术和临床应用专家讲座第40页实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems企业推出，因为该技术不但实现了PCR从定性到定量飞跃，而且与常规PCR相比，它含有特异性更强、有效处理PCR污染问题、自动化程度高等特点，当前已得到广泛应用。

PCR检测技术和临床应用专家讲座第41页

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量分析方法。

实时荧光定量PCRPCR检测技术和临床应用专家讲座第42页

在荧光定量PCR技术中，有一个很主要概念—Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值含义是：每个反应管内荧光信号抵达设定阈值时所经历循环数。荧光定量PCR原理PCR检测技术和临床应用专家讲座第43页Ct值图解PCR检测技术和临床应用专家讲座第44页荧光阈值（Threshold）设定

普通情况下把PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值缺省设置是3-15个循环荧光信号标准偏差10倍，即：Threshold=10×SDcycle3-15。PCR检测技术和临床应用专家讲座第45页Ct值与起始模板关系

研究表明，每个模板Ct值与该模板起始拷贝数对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数对数，纵坐标代表Ct值。所以，只要取得未知样品Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。PCR检测技术和临床应用专家讲座第46页PCR检测技术和临床应用专家讲座第47页Ct值和初始模板关系数学模式初始模板：X;PCR扩增效率：p;扩增到达某个固定阈值A时：X•(1+p)Ct=A对等式两边取对数：lgX+Ct•lg(1+p)=lgAlgX=lgA

–lg(1+p)•Ct由此可知样本初始模板浓度对数与样本扩增Ct值呈线性相关PCR检测技术和临床应用专家讲座第48页荧光探针和荧光染料

TaqMan荧光探针：PCR扩增时，Taq酶5‘-3’外切酶活性将探针酶切降解，使汇报荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同时。PCR检测技术和临床应用专家讲座第49页TaqMan荧光定量技术流程1234PCR检测技术和临床应用专家讲座第50页荧光探针和荧光染料

SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而确保荧光信号增加与PCR产物增加完全同时。PCR检测技术和临床应用专家讲座第51页实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地处理了传统定量只能终点检测局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号强度，并统计在电脑软件之中，经过对每个样品Ct值计算，依据标准曲线取得定量结果。所以实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上：PCR检测技术和临床应用专家讲座第52页实时荧光定量PCR无需内标Ct值重现性：PCR循环在到达Ct值所在循环数时，刚才进入真正指数扩增期（对数期），此时微小误差还未放大，所以Ct值重现性极好，即同一模板不一样时间扩增或同一时间不一样管内扩增，得到Ct值是恒定。Ct值与起始模板线性关系：因为Ct值与起始模板对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，所以，实时荧光定量PCR是一个采取外标准曲线定量方法。PCR检测技术和临床应用专家讲座第53页实时荧光定量PCR应用新药开发研究，人用药品及其它药品超早期感染用药品及疗法研究与开发药品疗效研究，人用药品及其它药品新愈后指标研究新诊疗及检验试剂开发血液检验漏诊率PCR检测技术和临床应用专家讲座第54页其它PCR定量技术

内参考法

竞争法

PCR-ELISAPCR检测技术和临床应用专家讲座第55页五、罗氏COBASAmplicor

乙肝检测仪PCR检测技术和临床应用专家讲座第56页世界上第一台用于临床诊疗PCR仪！NAT国际金标准FDA许可，SDA注册全球销售过4200台PCR检测技术和临床应用专家讲座第57页介绍COBASAmplicor乙肝检测仪是由Roche企业生产制造，它采取是PCR-ELISA方法，可对人血清和血浆中HBVDNA病毒进行定性检测。该分析方法允许同时对HBV靶值和HBV定量标准（QS）DNA进行PCR扩增PCR检测技术和临床应用专家讲座第58页HBV定量标准（QS）HBV定量标准是一个非传染性线性化质粒，其包含了与HBVDNA靶值相同引物结合位点和能够与HBV扩增子区分独特QS扩增子探针结合区域。HBVQS以已知拷贝数掺入每个个体标本中，经过标本制备、PCR扩增、杂交及检测步骤与HBV靶值一同被处理。COBASAmplicor检测仪经过计算HBV信号和QS信号比值来得出HBVDNA水平。PCR检测技术和临床应用专家讲座第59页DNA扩增/RNA逆转录后再扩增杂交光密度计测定与探针特异结合扩增产物显色样本制备

CobasAmplicor基本工作原理PCR检测技术和临床应用专家讲座第60页操作步骤

1、标本制备；

2、用HBV特异性互补引物对靶值DNA进行PCR扩增；

3、用特异于靶值寡核苷酸探针对扩增产物进行杂交；

4、经过比色仪来检测探针结合扩增产物。PCR检测技术和临床应用专家讲座第61页仪器简化检测工作流程温育，杂交冲洗，留下与探针结合扩增子CN4探针温育，CN4与生物素结合冲洗，洗去多出CN4SB3温育，SB3在CN4作用下显色检测，660nm处测吸光度变性液PCR检测技术和临床应用专家讲座第62页Amplicon稀释液3号样本扩增稀释液(1:729)样本原液

(1:1)QS扩增原液(1:1)25uL25uL25µl+200uL弃去150uL25uL1号样本扩增稀释液(1:9)QS(1:9)稀释液2号样本扩增稀释液

(1:81)

25uL25uL

COBASAMPLICORMONITOR

定量原理200uL200uL200uL25uLPCR检测技术和临床应用专家讲座第63页模板扩增过程No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 2