细胞培养技术专家讲座

细胞培养也叫细胞克隆技术。经过细胞培养得到大量细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中最关键、最基础技术。什么是细胞培养？细胞培养技术专家讲座第1页主要内容试验设备试剂及耗材清洗及灭菌细胞培养（细胞生长过程，细胞起源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）细胞培养技术专家讲座第2页一试验设备超净工作台，生物安全柜CO2培养箱倒置显微镜离心机电热恒温水槽液氮罐纯水仪压力蒸汽消毒器电热干燥箱细胞培养技术专家讲座第3页

超净台生物安全柜酒精灯（√），离开要熄灭！酒精灯（×）细胞培养技术专家讲座第4页CO2培养箱CO2培养箱设定条件为37℃，5％CO2

。倒置显微镜细胞培养技术专家讲座第5页离心机电热恒温水槽液氮：-196℃液氮罐配平细胞培养技术专家讲座第6页纯水仪压力蒸汽灭菌器电热干燥箱由工作人员操作，注意安全！细胞培养技术专家讲座第7页小结一试验设备及功效超净工作台，生物安全柜------操作平台CO2培养箱-------------------------细胞生长空间倒置显微镜-------------------------观察细胞离心机-------------------------------离心搜集细胞电热恒温水槽----------------------加热

液氮罐-------------------------------冻存细胞纯水仪-------------------------------制备一级水压力蒸汽消毒器--------------------灭菌电热干燥箱-------------------------烘干器皿（酒精灯安全）细胞培养技术专家讲座第8页二试剂及耗材培养基缓冲液消化液血清其它耗材细胞培养技术专家讲座第9页培养基

供给细胞营养和促使细胞增殖基础物质，也是培养细胞生长和繁殖生存环境。成份及作用：氨基酸：组成蛋白质基本单位碳水化合物：能量起源无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡维生素：维持细胞生长生物活性物质，在细胞代谢中起调整及控制作用细胞培养技术专家讲座第10页培养基分类

DMEM（高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纤维、上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原代神经元

DMEM（低糖，葡萄糖1000mg/L）：间充质干细胞，单抗细胞融合

RPMI1640：血液细胞（HL60）、一些实体瘤细胞（BT474）酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）；酚红能够模拟固醇类激素作用（尤其是雌激素），包括到激素和诱导试验，提议选取无酚红培养基。ATCC/美国模式培养物集存库细胞培养技术专家讲座第11页缓冲液（洗涤细胞）

PBS：磷酸缓冲盐溶液——含有pH缓冲作用等渗盐溶液（常规试验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离子，用于胚胎学方面研究。

Hanks：平衡盐溶液——无机盐和葡萄糖浓度靠近大部分动植物细胞水平，可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。

D-Hank’s：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时）。细胞培养技术专家讲座第12页消化液胰蛋白酶溶液

使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作用）平衡盐溶液（如PBS、D-Hank’s）。EDTA溶液

普通用其钠盐，可溶性很好。有些组织需要Ca2+

、Mg2+来保持其完整性，EDTA能够螯合这些离子，可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓解。使用浓度为0.02%，以无钙、镁平衡盐溶液配制。胶原酶溶液主要水解结缔组织中胶原蛋白成份（用胰蛋白酶效果较差），使用Hanks溶液配置，惯用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）。细胞培养技术专家讲座第13页提供基本营养物质、激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中细胞起到一些保护作用。保留血清最好方法？提议血清保留在-20℃。解冻后存放于4℃时，请勿超出一个月。（分装）怎样解冻血清才不会使产品质量受损?提议从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之迟缓解冻、融解。使用时，必须将解冻血清充分混匀，而且勿将血清置于37℃太久。

血清细胞培养技术专家讲座第14页青霉素-链霉素溶液

青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml。分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质组成，到达抑制细菌生长作用，预防污染，对真菌和支原体无效。其它试验所需试剂：药品（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子（如SCF）等细胞培养技术专家讲座第15页试剂标注规范试剂名称NaCl配制浓度0.5mM配制人张三配制日期.10.21细胞培养技术专家讲座第16页耗材培养皿、瓶、孔板离心管、移液管枪尖其它细胞培养技术专家讲座第17页小结二试剂及耗材分类及用途培养基（成份、分类）缓冲液（PBS、Hanks等）消化液（分类及应用）血清（作用、存放及解冻方法）试剂标签要规范耗材（分类、用途）细胞培养技术专家讲座第18页在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成份化学物质需要清洗培养用具:玻璃器皿、部分需要回收塑料制品。（包含：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个步骤）三清洗及灭菌细胞培养技术专家讲座第19页消毒灭菌方法物理消毒灭菌法Co60辐射（γ射线）：破坏生物大分子（塑料制品）紫外线（200-300nm）：30min，阻止细菌、病毒核酸合成。（细胞室：用于空气，操作台表面等）湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min，破坏微生物孢子、蛋白变性。（用于大量液体、玻璃器皿、部分塑料耗材、手术器械等，由工作人员操作）干热：160℃,2小时，高热作用下氧化作用破坏微生物（耐高温玻璃和金属制品）过滤：0.22μm滤膜过滤除菌（少许试剂）细胞培养技术专家讲座第20页消毒灭菌方法化学消毒灭菌法75%酒精主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃）1‰新洁尔灭主要用于器械浸泡，皮肤和操作室壁面擦试消毒（阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变其通透性而起杀菌作用）细胞培养技术专家讲座第21页需要清洗物品：玻璃器皿、部分需要回收塑料制品。清洗步骤灭菌方法：

-紫外线（超净台、生物安全柜）

-高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502）

-75%酒精（表面消毒，小心酒精灯明火）小结三清洗及灭菌细胞培养技术专家讲座第22页四细胞培养生长类型细胞起源细胞复苏细胞传代细胞冻存细胞计数活力测定污染种类细胞培养技术专家讲座第23页细胞生长类型

粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长细胞。（绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）

悬浮型细胞：无须附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长细胞。（主要是白血病细胞等）小鼠单核巨噬细胞白血病细胞细胞培养技术专家讲座第24页细胞贴壁过程细胞培养技术专家讲座第25页每代贴壁细胞生长过程游离期（接种后在培养液中呈悬浮状态，细胞质回缩，细胞体圆球形）贴壁期（细胞平均在10分钟－4小时贴壁，底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等）潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，普通为6～24小时对数生长久（细胞数随时间改变成倍增加，活力最正确。

最适合进行试验研究）停顿期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）（悬浮细胞没有贴壁过程）细胞培养技术专家讲座第26页国内能够买到细胞株地方有哪些？ATCC（美国模式培养物集存库）国内代理ECACC（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、sigma中国科学院细胞研究所中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部武汉大学冷藏中心等细胞起源细胞培养技术专家讲座第27页

确定细胞株培养信息（ATCC）配制培养基（基础培养基+10%胎牛血清+双抗）、胰酶、PBS无菌培养瓶、吸管、离心管准备准备工作细胞培养技术专家讲座第28页细胞复苏（快融）（l）从液氮中取出冷冻管，快速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。并注意水面不可超出冷冻管盖沿，不然易发生污染情形。（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。（3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏细胞。（4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。复苏过程应快融，目标是预防小冰晶形成大冰晶而损伤细胞。细胞培养技术专家讲座第29页细胞传代

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一个将细胞种保留下去方法。同时也是利用培养细胞进行各种试验必经过程。细胞培养技术专家讲座第30页细胞传代1悬浮细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

2半贴壁细胞传代（Hela细胞）这类细胞部分展现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。离心新鲜培养基悬浮铺板细胞培养技术专家讲座第31页细胞传代3贴壁细胞传代采取酶消化法传代。惯用0.25％胰酶。

吸掉上清，加入PBS缓冲液洗涤，弃掉洗液，加入适量胰酶消化液，37℃消化1分钟左右，加入含血清培养基终止消化，并离心去上清，重新稀释后接种。注意：开放式操作，小心慎重、谨防污染！细胞培养技术专家讲座第32页细胞冻存（慢冻）1细胞冻存液（1ml/管）基础培养基70％胎牛血清20％DMSO10％（二甲基亚砜，一个渗透性保护剂，可快速透入细胞，提升胞膜对水通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，降低胞内冰晶对细胞损伤。）2细胞欲冷冻保留时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目普通为1-8x106cells/ml迟缓冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大冰晶。细胞培养技术专家讲座第33页细胞冻存3慢冻程序传统方法：4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16－18小时（或过夜）→液氮长久保留。程序降温盒：利用异丙醇实现梯度降温（易挥发，而且易吸收空气中水分，冷冻过程中能够辅助实现迟缓降温，每十分钟降一度）。细胞培养技术专家讲座第34页细胞冻存细胞培养技术专家讲座第35页小结四细胞培养过程细胞生长类型及传代方法细胞培养过程注意无菌操作（全程）准备工作复苏（快）传代（无菌）冻存（慢）试验

细胞信息、方法冻存液成份、培养基、耗材程序细胞培养技术专家讲座第36页细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞细胞培养技术专家讲座第37页细胞计数计算公式：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×稀释倍数×

104细胞培养技术专家讲座第38页细胞计数注意事项记上不记下，记左不记右。吸收少许悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要确保盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡。镜下偶见由两个以上细胞组成细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。细胞培养技术专家讲座第39页培养细胞活力测定

细胞活力测定是体外试验研究中应用最广技术伎俩之一。

任何培养瓶内生长细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区分死、活细胞是困难。细胞培养技术专家讲座第40页培养细胞活力测定

1细胞克隆形成率试验

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成细胞群体形成肉眼可见克隆。克隆形成率用来表示细胞增殖能力。克隆形成率＝（克隆形成数／接种细胞数）×100%优点：准确、可靠，适于贴壁细胞细胞培养技术专家讲座第41页培养细胞活力测定

2台盼蓝法（0.4%）细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性细胞膜，与解体DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。用活细胞占细胞中百分比表示细胞活性。细胞培养技术专家讲座第42页培养细胞活力测定

3四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功效。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性试验等。细胞培养技术专家讲座第43页细胞培养污染类型细菌污染真菌污染支原体污染病毒污染非同种细胞污染化学污染细胞培养技术专家讲座第44页细菌污染小鼠胃癌细胞球菌感染细胞培养技术专家讲座第45页念珠菌污染真菌污染丝状菌污染细胞培养技术专家讲座第46页真菌污染经典霉菌污染，肉眼看到白色团块或白点，镜下呈丝状。400倍图片细胞培养技术专家讲座第47页支原体污染支原体污染电镜照片(X30k)，煎蛋状和其它形状

细胞培养技术专家讲座第48页

细菌和真菌污染多发生在传代、换液、加样等开放性操作之后。原代操作尤其注意！所以，细胞培养切记：“无菌”理念贯通一直，包含：器皿、器械、耗材、培养基、试剂、操作习惯。（一旦污染、马上弃用！）

怎样防止污染？细节决定成败！细胞培养技术专家讲座第49页小结五试验方法细胞计数方法细胞活力测定方法分类、原理及应用注意预防细胞污染细胞培养技术专家讲座第50页总结细胞试验所需设备类型