质粒DNA的提取和酶切专家讲座

质粒DNA提取与酶切试验四袁洁.10质粒DNA的提取和酶切第1页今天试验分2个部分：质粒DNA提取质粒酶切（电泳检测下次进行）质粒DNA的提取和酶切第2页一、试验原理质粒——质粒是存在于细菌体内一类独立于染色体自主复制遗传成份，在细胞内它们常以共价闭环超螺旋形式存在。质粒DNA的提取和酶切第3页质粒

(plasmid)质粒是存在于细菌体内一类独立于染色体自主复制遗传成份，在细胞内它们常以共价闭环超螺旋形式存在。

质粒已成为当前最惯用基因克隆载体分子。有一些质粒能携带外源DNA，能够作为目标基因进入受体细胞运载工具。质粒DNA的提取和酶切第4页2.目标基因和质粒载体连接3.将重组DNA分子导入受体细胞4.选择5.目标基因表示1.目标基因获取DNA片段（目标基因）与载体DNA分子相连接，形成重组DNA选出含有所需要重组体DNA分子受体细胞目标基因在受体细胞中高效表示，合成产物（蛋白质)重组DNA技术普通过程质粒DNA的提取和酶切第5页基因克隆示意图宿主基因组大肠杆菌+重组质粒质粒DNA的提取和酶切第6页质粒载体及其拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB115～20pUC系列质粒及其衍生质粒突变pMB1500～700pACYC及其衍生质粒p15A10～212pSC101及其衍生质粒pSC101～5ColE1ColE115～20质粒DNA的提取和酶切第7页质粒DNA普通特征

：①质粒是细菌内共生型遗传因子，有相对独立性。②它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型③它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等质粒DNA的提取和酶切第8页质粒三种构型：闭合环状DNA开环DNA——假如两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子因旋转而消除链张力。线状DNA——假如两条链均断开，即为线状DNA。质粒DNA的提取和酶切第9页质粒DNA与宿主菌染色体DNA区分：宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多质粒DNA的提取和酶切第10页分离纯化质粒DNA

三个主要步骤：①培养细菌使质粒扩增（DNA扩增与选择）②细菌搜集与裂解搜集——高速离心方法③质粒DNA纯化

全部纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状性质。质粒DNA的提取和酶切第11页碱法抽提质粒主要溶剂溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•Cl组成.葡萄糖作用是增加溶液粘度,降低抽提过程中机械剪切作用,预防破坏质粒.EDTA作用是络合掉镁等二价金属离子,预防DNA酶对质粒分子降解作用。Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用最适PH范围质粒DNA的提取和酶切第12页溶液Ⅱ：SDS、NaOHSDS作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性；NaOH作用是破坏氢键，使DNA分子变性。溶液Ⅲ：KAc、HAc溶液Ⅲ能中和溶液Ⅱ碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。质粒DNA的提取和酶切第13页SDS碱裂解法制备质粒DNA原理：

在有EDTA、溶菌酶及SDS存在条件下，用碱处理细菌，能够使细菌细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、蛋白质和RNA等）。

强碱环境能够使细菌线性分子染色体DNA氢键断裂，双链解开变性，而质粒DNA超螺旋共价闭合环状双链并不完全分离质粒DNA的提取和酶切第14页再加入高浓度酸性盐在有高盐存在条件下：线性染色体DNA凝聚成不溶性沉淀物；变性蛋白质与SDS和K+形成复合物也形成沉淀；小分子质粒DNA却呈天然构型，能溶解在buffer中

经过离心能够把线粒体DNA、不稳定大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起除去质粒DNA的提取和酶切第15页

假如要提升DNA纯度，则能够用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留蛋白质。质粒DNA的提取和酶切第16页试验步骤：加1.5ml培养物于EP管，1rpm×30s（可重复一次）

去上清（除净），加入100μl溶液I，充分重悬

加入200μl溶液II，马上、轻柔振荡数次

加入150μl冰溶液III，震荡10s，冰浴3~5min，1rpm×10min裂解细菌、释放质粒DNA质粒DNA的提取和酶切第17页转移上清到新EP管，加入等体积饱和酚（约450μl）振荡混匀，离心1rpm×10min转移上清到新EP管，加入等体积氯仿：异戊醇（共约450μl）振荡混匀，离心1rpm×5min除去杂质、纯化质粒DNA质粒DNA的提取和酶切第18页转移上清到新EP管

加入2倍体积乙醇（约800μl）混匀，冰浴15min离心1rpm×15min弃上清，

100μl70%乙醇洗沉淀，1rpm×2min

弃上清，静置干燥，0.1×TE20μl溶解DNA酶切判定（10μl）保留（10μl）除去杂质、纯化质粒DNA质粒DNA的提取和酶切第19页常见问题：提取DNA不纯，含有其它杂质（蛋白、多糖）变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或速度不够。提取DNA成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。混有染色体DNA：变性过程不完全试剂配置有问题。质粒DNA的提取和酶切第20页第二部分：酶切判定（双酶切）质粒DNA的提取和酶切第21页反应体系（20ml）试剂或样品用量（ml）BamHI1HindIII1Buffer2H2O6pUC119-U610共10ml，配好多份之后再分装质粒DNA的提取和酶切第22页酶切反应试验操作酶切反应液包含BamHI,HindIII,Buffer,H2O（已由准备试验老师配好）每人一份，每份10μl将酶切底物（质粒）与反应液混合充分混匀，瞬时离心37˚C，孵育1-3小时电泳检测（下次进行）质粒DNA的提取和酶切第23页基因工程诞生技术突破限制性内切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分离出第一个限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖质粒DNA的提取和酶切第24页限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链核酸内切酶起源：原核生物功效：自我保护——细菌限制和修饰系统（R/M体系）质粒DNA的提取和酶切第25页pUC119图谱质粒DNA的提取和酶切第26页重组质粒BamHIHindIII双酶切电泳检测5'-G

GATCC-3‘3‘-CCTACG-5'BamHI5'-AAGCTT-3'3'-TTCGAA-5'

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