细胞的破碎与分离包涵体课件

细胞的破碎与分离概述

很多生化产物存在于细胞内(胞内产物)细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。胞内物分离概述

药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤back酵母细胞壁结构一、细胞壁的组成和结构微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂类蛋白质细胞破碎机理图细胞破碎细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。细胞破碎1.珠磨法（Beadmill）细胞破碎高压匀浆器细胞破碎超声破碎法（Ultrasonication在15-25kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitationphenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。20Hz20000Hz正常人耳能听到的声音的频率范围超声次声细胞破碎撞击破碎化学破碎方法

酸碱法表面活性剂有机溶剂化学破碎方法通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。

1.破碎率的测定直接测定法目的产物测定法导电率测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。破碎率的测定破碎率的测定0.05%美蓝染色结果外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包涵体β-丙酰胺酶20%在细胞间区γ-人体干扰素25%形成包涵体凝乳酶原形成包涵体牛生长激素>30%形成包涵体β-内酰胺酶形成间区包涵体人胰岛素原5%~26%形成包涵体包涵体表达形式的优点

在一定程度上保持表达产物的结构稳定;

能避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集;

简化外源基因表达产物的分离操作;

能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体表达形式的缺点

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白。

体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包涵体获得

几种常见的工艺路线(一)机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）离心提取包含体加变性剂溶解除变性剂复性包涵体获得

几种常见的工艺路线（二）机械破碎膜分离获得包涵体加变性剂溶解包含体除变性剂复性1）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。包涵体的溶解包涵体的分离和蛋白质复性二硫键目的次级键变性剂去污剂还原剂盐酸胍、尿素SDS、Triton100巯基乙醇、DTT包涵体的复性包涵体的分离和蛋白质复性游离巯基次级键重新折叠形成复性通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的