固相萃取基本原理与操作

一、固相萃取基本原理与操作1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的1）疏水作用力：如C18、C8、Silica、苯基柱等2）离子交换作用:SAX,SCX，COOH、N”等3）物理吸附：Florsil、Alumina等2、pH值对固相萃取的影响pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的离子化程度则与pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍

有不同。1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图1）:0 活化--—除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）0 上样--一将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）0 淋洗一一最大程度除去干扰物。（建议此过程结束后把小柱完全抽干）0 洗脱一一用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）如下图1：

2）填料保留杂质固相萃取操作一般有三步（见图2）：0 活化一除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）0上样一将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快）0 洗脱--用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。（注意流速不要过快）此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。

如下图2图/固相萃取操作步骤（埴料保留杂质柱预处理样品添她 让法海干扰物图/固相萃取操作步骤（埴料保留杂质柱预处理样品添她 让法海干扰物二、固相萃取方法的建立与优化固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可通过下图来了解:方法建立如下图片i.jpg：

..②建）初步的方法炉8选择卒取方•法裂+J选择萃取SPE材料端选择洗脱溶剂口选择取样质量体积〃+J选捺样品基体处理方法裂③优化SPE方法”用新椎溶液过SPE村林斤物被洗脱的情况一用没有基液的标嘲'液对分析物进行萃取裂

好检险从基液中萃取号析物的情况a用新椎溶液过SPE村林斤物被洗脱的情况一用没有基液的标嘲'液对分析物进行萃取裂

好检险从基液中萃取号析物的情况aI好J检测干扰物是否与卦析物同时被洗脱QI好炉震V、方5去不好〃重新评估问题0

a1、初步固相萃取方法的建立建立初步的萃取方法要考虑：选择合适的SPE柱选择合适的固相萃取方法方法的优化2、固相萃取柱的选择＜1）柱填料的选择首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka值等，选择合适的填料。固相萃取柱的选择如下图片.jpg：

溶解干有机溶剂V溶解干有机溶剂V 甲醇或甲醉/水——士——己烧反相填料 正相麻一赢填料f控制国子化） 懈阴2附）*X▼CN.C18,PhenylIINHj.CH^DIotlIsiicaHcflall样晶3 A溶解于水捣干型—土 非高子型I 土 1I阳高干阴荫于反相填料反相填料林龊窗亍化|1 ， 4 4SCXSAXCia,C8hC2,CH.phenyl2）固相萃取柱规格的选择对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%（参考值，同一种SPE柱对不同的目标物选择性不同，吸附容量不同）；<P0cm="0cm"0cm?0pt?>离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。不同厂家的小柱离子交换容量稍有差异。下表附SPE小柱的容量和洗脱参数SPE柱上样容量和洗脱体积的选择规格最大上样量最小洗脱体积100mg/1mL5mg250PL200mg/3mL10mg500皿500mg/6mL25mg1.2mL1g/6mL50mg2.4mL3、选择合适的固相萃取方法固相萃取的保留机制可分为两种：吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）溶剂把目标组分洗脱下来。根据吸附剂的保留机理可进一步分为：(1)反相(C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1)分析物：非极性至中等极性基质：水溶性方法：a.活化：通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡b.淋洗：含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质以洗脱：极性或非极性溶剂洗脱目标物(2)正相(Silica,Florisil,Diol,NH2)分析物：中等极性到强极性基质：非极性至中等极性方法：a.活化：非极性有机溶剂b.洗脱：非极性有机溶剂如下图片：反相溶清洗脱强度p己烷4异辛烷4四氯甲烷?氯仿¥二氯甲烷一四氢味喃4乙麟川乙酸乙酯炉丙酮炉乙脂央异丙醇裂

甲醇媪水¥正相谢洗脱/度J（3）阳离子交换（SCX,PRS,COOH）u分析物：阳离子（碱性）化合物u方法：.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。.上样：样品溶液pH值要小于其pKa两个单位（以保证其带电荷）.洗脱：洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）（4）阴离子交换（SAX,PSA,NH2,PAX/MAX）u分析物：阴离子（酸性）化合物u方法:.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。.上样：样品溶液pH值要大于其pKa两个单位（以保证其带电荷）。.洗脱：洗脱溶液pH值要小于其pKa两个单位（中和分析物的电荷）。u吸附剂（填料）保留杂质：食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。（1）活化：以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2柱管体积（2）上样：提取液转移至柱内，并收集流出液（3）洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱流出液。4、固相萃取方法的优化1）影响萃取效率的因素（1）填料（固定相）——核心选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提。（2）洗脱溶剂的强度：0 采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加；0 采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。（3）pH值：离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。（4）操作：控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等2）常见问题及解决方法・分析物回收率低•萃取重现性差

冲溶液），水淋洗小柱后，用乙酸乙酯洗脱目标物。结果：接受液混浊状，回收率和重现性都不理想，可能是什么原因呢？答案：正确的做法是要在淋洗过程结束后把小柱完全抽干。原因有二，其一因为淋洗溶剂（水）与洗脱溶剂（乙酸乙酯）不互溶，如果不抽干洗脱溶剂与目标物不能充分作用，所以造成回收率和重现性都没有保证，同时从外观上看接受液是液混浊液；其二如果淋洗过程不抽干小柱，洗脱溶剂里会引入水（淋洗剂），对下一步浓缩造成很大的困难。相关图片如下：0I2、水中的灭草松前处理方法取500ml水样过滤，待过CleanertPEP柱（相当于WatersHLB）净化1）用5mL四氢呋喃洗柱子，除掉杂质2）用5mL甲醇1mL/min活化柱子用5mL纯水1mL/min活化柱500mL的水样以5mL/min的速度过柱5mL纯水2mL/min淋洗小柱真空抽干20min0.9mL的甲醇1mL/min淋洗，弃去淋洗液8）3mL四氢呋喃1mL/min的速度洗脱柱子，收集洗脱液浓缩定容至3mL液相检测。结果：回收率不理想，请问此方法有何问题？答案：因为目标物灭草松呈酸性，pKa=3.3,而选择的小柱PEP是极性的。所以正确的做法是样品在过柱之前一定要调节水样的pH值小于等于3,使目标物分子化，以保证目标物能被小柱充分保留，否则在上柱的过程中容易造成“漏”的现象，从而造成回收率差。三、固相技术应用实例解析1、食品领域应用1）动物组织中盐酸克仑特罗等4种代激动剂药物残留检测（CleanertPCX,P/N:CX1506）.实验材料固相萃取小柱：PCX（150mg/6mL）四种B-激动剂药物：盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种B-激动剂药物。.试样的制备取猪肝空白样品，经过液液萃取初步处理后，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试样。.净化依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱，将上述备用液过柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱，收集洗脱液于具塞玻璃试管中，50℃下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。.衍生化及检测将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50℃烘箱中加热片刻，除去水分后，加入甲苯100mL和双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100mL，涡旋振荡20s，密封玻璃塞，置于80℃恒温烘箱中加热1小时，冷却后加入300mL甲苯，作为试样溶液，供气相色评质谱分析（色谱柱:DA-5MS,30mx0.25mmx0.25pm，P/N:1525-3002）。.结果回收率实验（精密度和准确度）将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，配制1pg/L、2Pg/L、5pg/L、10pg/L和100pg/L五个浓度的试样溶液，每批次内同一浓度做5次平行实验，共4个批次（样品典型回收率色谱图见附图）。猪肝中实验结果列表如下添加浓度

（Pg/L）回收浓度

添加浓度

（Pg/L）回收浓度

（Pg/L）平均回收值

（Pg/L）平均回收率（%）相对标准偏差（%）0.6710.720.7272.405.930.700.781.621.6621.601.6381.301.231.611.644.024.1054.274.2484.804.164.384.438.248.35108.778.4584.452.818.628.2590.2487.1510091.779.1291.152.8692.6293.95重复性实验（批间误差实验）：猪肝中实验结果列表如下批间1平均回收率%RSD%2平均回收率%RSD%添加浓度（隰/L）5 10平均平均回收RSD%回收率%率%RSD%平均回收率%100RSD%172.405.9381.303.4984.806.1684.453.5991.152.86275.376.1280.475.3784.747.5587.464.6890.053.86370.097.8580.806.5783.108.1783.215.3989.534.16476.734.9078.508.3582.905.1185.955.7288.275.93平均值73.656.2080.255.9583.886.7585.274.8489.754.20RSD%12.9510.799.437.005.75附图：猪肝中0.5pg/L、1pg/L、2pg/L、5pg/L、10|Jg/L和100|Jg/L六个浓度检测结果总离子流图（TIC）代表图谱：猪肝+1ppb（PCX）2）鸡蛋中三聚氰胺的检测（CleanertPCX,P/N:CX0603）1材料和方法主要仪器和试剂，色谱柱（VenusilASBC8,4.6*250mm，5pm，艾杰尔科技），混合型阳离子交换固相萃取柱（CleanertPCX，60mg/3mL，艾杰尔科技），12位固相萃取装置（艾杰尔科技），高效液相色谱仪；高速离心机；超声波震荡仪；涡旋混合器；分析天平（万分之一）；溶剂过滤器（带0.45pm有机、水系过滤膜和真空泵）；乙腈（HPLC级）；三聚氰胺标准品（＞99.0%）；柠檬酸（分析纯）；庚烷磺酸钠（色谱级）；水（二次蒸馏水以上）。色谱条件：色谱柱：VenusilASBC8，4.6*250mm，5pm；流动相：乙腈：10mM/L柠檬酸+10mM/L庚烷磺酸钠缓冲液=7:93（pH=3.0）检测波长：240nm；流速：1mL/min；进样20pL。

2实验部分三聚氰胺标准溶液配制：称取三聚氰胺标样10.0mg,加流动相溶解定容至100mL,即得浓度为100mg/L的三聚氰胺标样溶液。将浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L的标准品溶液，用0.45pm滤膜过滤后进液相色谱检测。1%三氯乙酸溶液溶液的配制称取三氯乙酸1.00g，加水溶解定容至1000mL即得。5%氨化甲醇的配制准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。5%醋酸铅溶液的配制称取5.0g醋酸铅，加水溶解定容至100mL即得。混合型阳离子交换固相萃取柱(CleanertPCX60mg/3mL)的活化取CleanertPCX固相萃取柱，以3mL甲醇，3mL水依次过柱活化，弃去流出液，备用。加标样本处理将鸡蛋打开搅匀，分别称取1.00g鸡蛋样本置于10mL具塞离心管中，分别加入100mg/L三聚氰胺标样溶液10pl、20pl、100pl，分别得到添加浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg、10.0mg/kg的样本。往装有上述样本的具塞离心管中分别加入10mL1%三氯乙酸溶液，2mL5%醋酸铅溶液，摇匀，超声20分钟，8000rpm离心10分钟，全部上清液转入活化好的混合型阳离子交换固相萃取柱(CleanertPCX，60mg/3mL)，依次使用3mL水，3mL甲醇淋洗，抽干，弃去淋洗液。最后用5mL5%的氨化甲醇洗脱川/V)，接收洗脱液，50℃氮气吹干，用1mL流动相定容，0.45Pm滤膜过滤后进液相色谱检测。另取空白鸡蛋样本1.00g，不添加三聚氰胺照上述方法处理，作为空白对照样品。3实验结果：

由图1可见，用该方法处理，三聚氰胺峰型对称尖锐，且与杂质分离良好3.2精密度分别移取浓度为1.0mg/L、5.0mg/L的三聚氰胺标准溶液，分别连续进样6次，结果如表1所示。表1保留时间与峰面积的稳定性数据由图1可见，用该方法处理，三聚氰胺峰型对称尖锐，且与杂质分离良好3.2精密度分别移取浓度为1.0mg/L、5.0mg/L的三聚氰胺标准溶液，分别连续进样6次，结果如表1所示。表1保留时间与峰面积的稳定性数据鸡蛋空白样品图谱裂图片如下图1鸡蛋空白样品和鸡蛋添加1口ppm的样品图谱会浓度mg/mL指标1#2#3#4#5#6#平均值RSD%保留时间18.83018.82918.82918.83818.84018.83418.8330.0261.0（min）峰面积898184888480844.286保留时间18.94918.95218.94718.94918.95018.94618.9490.0115.0（min）峰面积4234404384394374384361.461由表1结果可见，本方法具有很好的精密度和重现性。表2标准校正曲线实验数据浓度峰面积浓度峰面积mg/kg第1次进样1.0895.042310.083215.0126520.01689峰面积峰面积第2次进样均值79844404318448381299128218231756浓度与峰面积的回归曲线¥根据以上数据计算线性方程为：y=87.43x-13.67,R2=0.999浓度与峰面积的回归曲线¥根据以上数据计算线性方程为：y=87.43x-13.67,R2=0.999，相关曲线见图2。3.4添加回收率表3添加浓度与回收率数据2口。015001000结果显示，；该方法在卜Rmg/kg范围内线性关系艮好。一V=S7,d38x-13.672添加浓度(mg/kg)峰面积计算含量回收率(%)1.019.91.158892115.891.021.01.214532121.452.041.72.261587113.082.040.82.216062110.8010.0188.89.70224797.0210.0219.611.26018112.60由表3可见，本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好。4结论

通过上述实验可见，运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺，基质净化效果好，杂质干扰小，色谱峰型良好对称度高，操作简单方便，和准确度高等优点，非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的检测。[2010-9-1512:53:21Lasteditbypjs123]仪器专场展示：离子色谱色谱柱离子色谱柱关键词：固相萃取原理及应用萃取技术2、环境检测应用1)水中酚类检测(CleanertPEP,P/N:PE0603)1实验材料：SPE小柱：CleanertPEP500mg/6mL7种酚类：苯酚，4-硝基酚，间甲酚，2-氯酚，2,4-二氯酚，2,4,6-三氯酚，五氯酚2实验过程.样品前处理方法1)活化：依次用5mL甲基叔丁基醚(10:90,V/V)、5mL甲醇活化富集柱、5mL去离子水活化CleanertPEP柱，5mL/min2)上样：1L的水样过柱，＜5mL/min3)淋洗：10mL去离子水淋洗小柱，5mL/min,然后真空抽干20min4)洗脱：2mL甲醇/甲基叔丁基醚(10:90,V/V)分两步洗脱，收集洗脱液至尖嘴瓶中5)浓缩：将收集的2mL洗脱液，氮气浓缩至1mL.色谱条件色谱柱：VenusilMPC18(4.6*150,5|jm)流动相：A：1%乙酸B：1%乙酸甲醇检测器：UV检测器梯度洗脱程序：时间流动相比例流速(mL/min)检测波长(nm)0-15minA:B=50:50127515-30minA:B=15:851.8295图片如下:注;1、苯酷34-注;1、苯酷34-硝基酚3；间甲酚4.2氯酎5,24二氯酚6,2,4咛三氯配7-3.实验结果七种酚在水中的添加回收率见表1.表1.七种酚类在水中的添加回收率结果加标平均值标准偏差平均回收率(%)123苯酚1.3671.5411.5241.4770.096100.34-硝基酚1.2291.3081.4301.3220.10190.0间甲酚1.2941.5401.5481.4610.144106.32-氯酚0.5270.6840.6410.6170.081100.62,4-二氯酚1.3051.6131.6211.5130.18092.82,4,6-三氯酚1.3651.6091.5111.4950.12390.3五氯酚1.2591.4871.4721.4060.12895.62)水中的多环芳烃固相萃取方法(CleanertPEP,P/N:PE0603).材料目标物成分萘，苊，苊烯，芴，菲，蒽，荧蒽，芘，屈，苯并(a)蒽，苯并(k)荧蒽，苯并(a,h)荧蒽，苯并(a)芘，苯并(g,h,i)芘，茚并(1,2,3-cd)芘.SPE柱：CleanertPEP(60g/3mL).样品处理：1L水中加入20mL10%的硝酸.SPE方法

1）活化：5mL异丙醇和5mL水分别依次活化PEP柱2）上样：把处理好的水样过PEP柱）淋洗：用5mL淋洗液（300mL水+700mL甲醇+2.1gNa2HPO4+2.04gKH2P04）淋洗4）抽干：抽真空干燥柱管30min5）洗脱：用4mL洗脱液（901^异丙醇+10mL冰醋酸+200mL甲苯，加入到1L石油醚中），混合均匀洗脱，收集洗脱液6）浓缩，定容.色谱条件：色谱柱：VenusilPAH专用柱（4.6x250mm，5pm，200A）样品：溶于MeOH:CH2cl2（1:1）16PAHs标品，用MeOH:CH2cl2（1:1）稀释10倍流速：1.2mL/min进样量：10pL柱温：30℃波长：254nm甲醇/水线性梯度洗脱，梯度表如下T（min） MeOH（%） H2O（%）TOC\o"1-5"\h\z0 85 152 85 157 95 540 95 5图片如下分析结果〉裂图116种多环芳煌供试品色谱图V

¥1、禁；2、荒；或危烯「二氢荒；4、现5、菲；6、盛..7：灵期’&tE;或苯并；：a）惠1口、屈；11、苯并（b）荧；12、荒井（kj荧l13、茶井上吟花；14、荔并tghi：1二15二季井（a,hj患?二16、许并11■.1> 3-cd.■-：

3）水中硝基苯的固相萃取方法（CleanertPEP,P/N:PE0603）SPE柱：CleanertPEP（500mg/6mL）样品制备:分析前应先调节水样pH值为中性，向每份水样中加人甲醇使甲醇浓度为0.5%。混匀。SPE方法：PEP柱活化：将PEP柱置于固相萃取装置的针座圈上，用3mL正己烷预洗萃取柱，加人5mL甲醇，在甲醇完全流过萃取柱前加入10mL试剂水，使柱床处于湿润和活化状态。样品的富集：根据水样浓度准确量取适量水样于分液漏斗中，开启固相萃取装置真空系统，使水样连续通过活化过的萃取柱保持流速不超过5mL/min进行萃取，在萃取过程中要始终保持柱床上至少有1cm高水样。当所有样品都通过萃取柱后，