食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第1页一、菌落总数介绍食品验样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成份、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g)验样中形成菌落总数。国家标准要求培养条件下所得结果，只包含一群在营养琼脂上生长发育嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌菌落总数。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析●

食品污染程度标志●

预测食品存放期限卫生学意义食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第2页二、检验方法菌落总数测定，普通将被检样品制成几个不一样10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（普通为48小时），统计每个平皿中形成菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每mL）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作普通包含：样品稀释----倾注平皿----培养48小时----计数汇报。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第3页三、检验程序GB/T4789.2-

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第4页四、操作步骤（一）最先准备器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）

规格名称 数量 1、500mL广口瓶 1个 2、500mL三角瓶 1个 3、250mL三角瓶 2个 4、18×180mm试管 3支 5、1mL移液管 5支6、直径为90mm平皿 10套 7、250mL量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm9、剪刀1把不锈钢药匙1把

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第5页样品：袋装鲜奶1．操作方法用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25mL，放入装有适量玻璃珠灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热灭菌生理盐水渐渐加入，振摇均匀，即为1:10稀释液。用1mL灭菌吸管吸收1：10稀释液1mL，沿管壁渐渐注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上项操作次序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析（二）样品处理和稀释食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第6页

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析（二）样品处理和稀释食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第7页1．操作方法依据标准要求或对污染情况预计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释同时，以吸收该稀释度吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析（二）样品处理和稀释食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第8页（四）菌落计数1、计数时应选取菌落数在30~300之间平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有要求不考虑其比值大小，均以平均数汇报）。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，统计稀释倍数和对应菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第9页2、若全部稀释度均不在计数区间，如均大于300，则取最高稀释度平均菌落数乘以稀释倍数汇报之；如均小于30，则以最低稀释度平均菌落数乘稀释倍数汇报之。如菌落数有大于300，有又小于30，但均不在30~300之间，则应以最靠近300或30平均菌落数乘以稀释倍数汇报之。如全部稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数汇报之。（四）菌落计数

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第10页3、不一样稀释度菌落数应与稀释倍数成反比，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中差错，不应作为检样计数汇报依据。4、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长菌落之间无任何显著界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不一样起源链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板普通不宜采取，如片状菌落不到平板二分之一，而另二分之一又分布均匀，则能够半个平板菌落数乘2代表全平板菌落数。（四）菌落计数

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第11页（四）菌落计数

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第12页5、当计数平板内菌落数过多（即全部稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板二分之一或1/4计数。再乘以对应稀释倍数作为该平板菌落数五、菌落数汇报按国家标准方法要求菌落数在1~100时，按实有数字汇报，如大于100时，则汇报前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。汇报方式以下表为例（四）菌落计数

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第13页

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节总菌落数检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第14页第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第15页大肠菌群是指一群在37℃培养24小时能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。作为粪便污染指标，有广泛卫生学意义。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第16页第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第17页检测步骤食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第18页1、检样稀释MPN：表示食品中大肠菌群数是以每100mL或克检样内大肠菌群最近似值，普通采取9管法。普通样品25mL（克）+225mL生理盐水=1：10，从此10-1取样10mL，则其中含样品为1mL（克）。接种到3管双料乳糖发酵管中。从此10-1取样1mL，则其中含样品为0.1mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。表142—143。从10-1取样1mL+9mL生理盐水=1：100，从10-2取样1mL，则其中含样品为0.01mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第19页2、乳糖发酵试验（1）培养基单料乳糖胆盐发酵管：蛋白胨2%猪胆盐（或牛胆盐）0.5%乳糖1%、1.6%溴甲酚紫酒精液0.06mlpH7.4。制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。

双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外其它成份加倍。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第20页（2）原理溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，假如颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸大肠菌群；假如颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸大肠菌群。胆盐能够抑制其它细菌生长繁殖。分解乳糖产酸产气大肠菌群，看小倒管中气体。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第21页杜氏发酵管产气情况1产气2不产气

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第22页判别培养基名称加入化学物质微生物代谢产物培养基特征性改变主要用途H2S试验培养基糖发酵培养基伊红美蓝培养基醋酸铅溴甲酚紫伊红、美蓝H2S乳酸、醋酸、丙酸等酸产生黑色沉淀由紫色变成黄色带金属光泽深紫色菌落判别产H2S菌株判别肠道细菌判别大肠菌群3、判别和分离培养

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第23页4、证实试验（1）革兰氏染色：阴性、短杆菌（2）乳糖复发酵：产酸产气

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第24页粪大肠菌群检验检验稀释乳糖发酵试验证实证验（EC肉汤发酵伊红美蓝培养基）结果评定

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第25页EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤,E.ColiBroth

）

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第26页第一个半天器材准备准备器材并灭菌，以下：1、250mL三角瓶1个2、18×180mm试管2支3、乳糖发酵管（带黑帽或棉塞，有刻度试管，内带小倒管）15支4、250mL量筒1支5、1mL移液管2支6、10mL移液管2支7、平皿6套

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第27页第二个半天样品处理及初发酵1、样品处理2、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验3、培养18—26小时，于35—37摄氏度

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第28页第二天伊红美蓝培养基分离培养[接种EC肉汤（粪大肠菌群）1、伊红美蓝培养基分离培养2、接种EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤,E.ColiBroth

）

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析

伊红Y是一个酸性染料,有色部分为阴离子(E-)美蓝是一个碱性染料,有色部分是阳离子(M+)。细菌细胞主要成份是蛋白质,因为蛋白质系两性电解质,在偏酸性环境中正电荷增多,易与伊红结合,在碱性环境中负电荷增多,易与美蓝结合。而细菌发酵乳糖是产酸.美蓝并不是完全不起作用，多见于经典大肠杆菌(乳糖发酵很快速),在伊红染成粉红色之后,美蓝能够继续将其染成紫黑色带金属光泽菌落。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第29页第三天证实试验1、乳糖复发酵试验2、从阳性EC肉汤接种EMB分离培养。3、EMB经典菌落革兰氏染色镜检

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析革兰氏染色：阴性、短杆菌食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第30页第四天观察结果与器材消毒与清洗1、观察乳糖发酵管结果2、观察EMB培养结果并革兰氏染色镜检3、器材消毒与清洗4、查表汇报结果与撰写试验汇报

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节大肠菌群检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第31页

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第32页沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原结构相同革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。一、沙门氏菌生物学特征

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第33页

1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有专对人类致病，有只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引发对人类、家畜以及野生禽兽不一样形式总称。感染沙门氏菌人或带菌者粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引发食物中毒常列榜首。中国内陆地域也以沙门氏菌为首位。

1、沙门氏杆菌介绍

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第34页沙门氏菌病是公共卫生学上含有主要意义人畜共患病之一，沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。造成胃肠炎、伤寒和副伤寒细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包含哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。已发觉近一千种（或菌株）。按其抗原成份，沙门氏菌可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病相关主要有甲组副伤寒甲杆菌，乙组副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组伤寒杆菌和肠炎杆菌等。

1、沙门氏杆菌介绍

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第35页形态、染色G-杆菌0.6-1.0um×2-4um周身鞭毛，有菌毛。沙门氏杆菌形态大小

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第36页生化反应不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第37页沙门菌病当前最少有67种O抗原和个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。肠热症----是伤寒病和副伤寒病总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引发。急性肠炎（食物中毒）----是最常见沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引发。败血症----常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引发。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第38页三、沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-微生物学检验

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第39页冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃普通4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL＋MM（或TTB）100mL检样匀液25mL＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学试验甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－赖＋H2S－靛－尿－KCN－赖＋/－非如左述各种反应结果沙门氏菌血清学试验ONPG－沙门氏菌非沙门氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第40页前增菌：25克（加工食品）+225毫升缓冲蛋白胨37度培养4小时（干蛋品18—24小时）。增菌：移取10毫升接种于100mL增菌液中。氯化镁孔雀绿（MM）或四硫酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）。（一）前增菌和增菌（二）分离培养最适生长温度为35～37℃，最适pH值为6.8～7.8。选择性琼脂平板：BS培养基（亚硫酸铋琼脂）、DHL琼脂、HE（海克顿肠内琼脂培养基）或WS琼脂、SS琼脂。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第41页选择琼脂平板沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）亚硫酸琼脂(BS琼脂)产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变。黑色有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色。乳糖迟缓阳性或阴性菌株与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性菌株为粉红色，中心带黑色。HE琼脂WS琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色。乳糖阳性菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色。SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株有菌落中心带黑色，但不如以上培养基显著.乳糖迟缓阳性或阴性菌株，与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区分.第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第42页

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第43页（三）五项生化试验1、三糖铁琼脂试验2、靛基质试验（吲哚试验）3、尿素酶试验4、氰化钾试验（KCN）5、赖氨酸脱羧酶试验

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第44页1、三糖铁（TSI）试验

肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产酸。三糖铁琼脂试验是利用糖类发酵之不一样与硫化氢产生是否，将肠道杆菌科各组细菌或各菌属加以区分。

三糖铁琼脂斜面培养基含有1﹪乳糖及蔗糖与0.1﹪葡萄糖作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵。测试时使用接种针先穿刺至底部，而后于斜面作划线接种，经培养18-24小时后，依情况判断糖类之发酵情形。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第45页制好培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO2

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第46页（1）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色+）产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸马上氧化而呈碱性反应，同时培养基中蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应。（2）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色+）产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。因为乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保持酸性反应。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第47页（3）斜面碱性（红色-）底部碱性（红色-）或无改变（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。

为使结果准确，应于接种培养18-24小时内观察结果，以确保糖类还未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物还未产生。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第48页培养基变黑（4）三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠作为产生硫化氢之基质，且含硫酸亚铁作为检测此无色产物之指示剂，经接种培养后，若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第49页2、靛基质（吲哚）试验阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第50页3、尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第51页5、赖氨酸脱羧酶试验对照阳性（紫）阴性（黄）

4、氰化钾试验“浑浊”为“+”

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第52页ONPG试验阳性（黄）空白丙二酸盐试验阳性（兰）阴性（不变）

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第53页第一天器材准备、样品处理和增菌培养规格名称 数量

1、500mL三角瓶 2个 2、15×150mm试管20支 3、1mL移液管 5支4、10mL移液管 2支5、直径为90mm平皿 12套 6、250mL量筒 1支其它：均质器、玻璃珠等。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第54页第二天接种选择性平板进行分离培养从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)和赖氨酸脱羧酶试验培养基。第四天观察五项生化试验结果，判断沙门氏菌属性。第三天观察分离结果

第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节沙门氏杆菌检验与分析食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第55页第三节志贺氏菌检验食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第56页（一）形态与染色

革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。2~3um×0.5~0.7um一、志贺氏菌生物学特征第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第57页（二）培养特征1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.42、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小菌落3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第58页（三）生化反应1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。4、甲基红阳性。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第59页二、志贺氏菌致病性与食物中毒（一）传染源食物、病人、粪便、苍蝇等（二）志贺氏菌致病性致病原因：侵袭力、菌体内毒素、外毒素。临床症状：A、急性细菌性痢疾：急性经典、急性非经典、急性中毒性菌痢。B、慢性细菌性痢疾：慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第60页GB/T4789.5-

中志贺氏菌检验程序三、志贺氏菌检验食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第61页（一）试验内容样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→结果汇报第一天样品处理和增菌培养早晨准备并灭菌器材下午规格名称 数量1、样品处理无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打坏1min。2、增菌培养放于36℃培养6～8h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。500ml广口瓶1个18×180mm试管6支13×100mm试管 13支10ml移液管 1支直径为90mm平皿6套250ml量筒1支不锈钢汤匙1把，玻璃珠，杜氏小管第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第62页第二天接种选择性平板进行分离培养（一）接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。（二）培养放于36℃培养18～24h。结果：志贺氏菌在这些培养基上展现无色透明不发酵乳糖菌落。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第63页HE平板原理及反应发酵乳糖肠杆菌不发酵乳糖某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌不发酵乳糖，菌落呈蓝绿色或蓝色可能就是志贺氏菌第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第64页SS平板原理及反应SSAgar(SalmonellaShigellaAgar)大肠杆菌或者别发酵乳糖肠杆菌。是沙门氏菌。有黑色中心。假如没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第65页麦康凯琼脂平板

菌落为粉红色，半透明，可能为志贺氏菌。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第66页EMB平板照片及原理

菌落为无色半透明状，可能为志贺氏菌。

大肠杆菌第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第67页第三天初步生化试验（一）接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基从HE或SS、麦康凯或EMB琼脂平板、挑取平板上可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。普通应多挑几个菌落，以防遗漏。经36℃培养18～24h，分别观察结果。（二）培养放于36℃培养18～24h。结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少许气体)，无动力。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第68页志贺氏菌在TSI生长结果（现象）：（1）斜面产碱仍为红色或粉红色；（2）底层产酸不产气，变黄色；（3）不产H2S，不出现黑色。志贺氏菌在葡萄糖半固体培养基生长：沿线生长，无动力。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第69页三糖铁（TSI）琼脂试验原理2－志贺氏菌3－沙门氏菌4－大肠杆菌

葡萄糖半固体原理及结果1.铜绿假单胞菌

2.志贺氏菌

3.枯草芽孢杆菌第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第70页在志贺氏菌检验中可弃去培养物：（1）在TSI表面上展现蔓延生长培养物（2）在18~24h发酵乳糖、蔗糖培养物（3）不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长培养物。（4）产气培养物（5）有动力培养物（6）产H2S培养物第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第71页第四天深入生化试验凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少许气体)，无动力菌株，可做深入生化试验和生化分型试验。（一）深入生化试验即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以及水杨苷和七叶苷分解，36℃培养。志贺氏菌属培养物均为阴性结果。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第72页（二）生化分群试验接种生化培养基从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到：5%乳糖、靛基质培养基中，36℃培养。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第73页各项生化试验现象葡萄糖铵：阳性者斜面上有正常大小菌落生长，阴性者不生长或生长极微小菌落。西蒙氏柠檬酸盐：阳性者斜面上菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，阴性者不生长。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶：阳性者为紫色，阴性者为黄色。pH7.2尿素：阳性者为红色，阴性者为黄色。KCN：阳性者细菌生长，阴性者细菌不生长。水杨苷和七叶苷：阳性者产气。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第74页（三）结果汇报综合生化试验结果判定菌型并作出汇报。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第75页第四节金黄色葡萄球菌检验第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第76页一、金黄色葡萄球菌生物学特征革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第77页大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团展现出深橙色到浅黄色，色素产生取决于生长条件，故称金黄色葡萄球菌。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第78页大多数菌株最适生长温度30-37℃，最适pH为7.0-7.5；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。普通用含10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第79页全部毒株产生血浆凝固酶，人和动物起源菌株通常可凝固兔、人、马和猪血浆。金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第80页生物学特征——致病性金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力强弱主要取决于其产生毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引发肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。b.杀白细胞素：可破坏人白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，妨碍吞噬细胞吞噬作用。d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶）

e.肠毒素：引发急性胃肠炎。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第81页金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见病原菌，临床表现各种多样，可引发局部化脓感染，也可引发肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第82页葡萄球菌皮肤感染第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第83页葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引发疾病，可引发不一样程度急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量肠毒素。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第84页二、检验程序与操作方法依据中华人民共和国国家标准：《食品卫生微生物学检验》GB4789.10-金黄色葡萄球菌检验第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第85页检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水国家标准：金黄色葡萄球菌检验程序直接计数方法增菌培养方法Baird-parker（贝尔德-帕克）0.3ml、0.3ml、0.4ml7．5％氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤血平板血平板，Baird-parker涂片染色观察溶血血浆凝固酶试验报告36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第86页检验程序——增菌培养利用金黄色葡萄球菌耐盐特征（可耐受15%氯化钠），用含10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤或7.5%氯化钠肉汤增菌。置37摄氏度培养箱培养24小时。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第87页检验程序——分离培养血平板：金黄色葡萄球菌能够产生溶血素，所以在血平板上产生显著溶血环。经典菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第88页大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第89页血平板制作成份：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。制法：加热融化琼脂，冷至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第90页BP（贝尔德-帕克）平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素丙酮酸钠是一个生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外其它能分解卵黄菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外其它菌株有抑制作用。检验程序——分离培养第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第91页在BP平板上经典菌落为：灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶粘稠感。长久保留冷冻或干燥食品中所分离菌落，其黑色常较经典菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第92页B-P平板第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第93页革兰氏阳性，球形，组成葡萄状检验程序——判定之革兰氏染色镜检第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第94页检验程序——判定之凝固酶试验金黄色葡萄球菌能够产生血浆凝固酶，所以对其判别主要试验是测定其凝固酶。方法一：试管法吸收1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃恒温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如展现凝固，即将试管倾斜或倒置时，展现凝块者，被认为阳性结果。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第95页试管法第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第96页阳性反应阴性反应不凝固少许、零碎凝固显著块状凝固巨大块凝固完全凝固，倒置不流动第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第97页有凝块血浆均匀混浊生理盐水方法二：玻片法

在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10~20s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第98页

兔血浆制备成份：柠檬酸钠0.106mol/L（31.3gNa3C6H5O7·2H2O溶于1L蒸馏水中）制法：一份加兔血9份混合后离心rpm，10min吸收上清液即为兔血浆。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第99页葡萄糖肉浸液肉汤制备成份：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6。制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压搜集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH，煮沸并过滤、分装，121℃30min高压灭菌。第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第100页25g样品+225ml生理盐水

5mL样品匀液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉汤血平板36±1℃

24hr

镜检与肉浸液肉汤培养血浆凝固酶试验

汇报结果

定性检测36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

36±1℃6hr

BP平板第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第101页25g样品+225ml生理盐水

选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板计数（分别统计每种类型菌落数）36±1℃

48hr

血平板、镜检与肉浸液肉汤培养血浆凝固酶试验汇报结果金葡菌数/g(mL)定量检测（平板法）每种类型选取一个菌落

36±1℃

24hr

36±1℃

6hr

适合用于检测金黄色葡萄球菌数大于10/g（mL）食品计算方法：（三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加）×血浆凝固酶阳性数÷5×稀释倍数梯度稀释

第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第102页第一天器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种早晨：准备器材第一天下午规格名称数量1、样品处理：鱼干、腊肉2、增菌培养3、BP平板制备及分离接种4、采集兔血准备：抗凝剂制备、灭过菌容器和玻璃珠250ml三角瓶1个10×100mm试管6支1ml移液管2支10ml移液管2支直径为90mm平皿8套250ml量筒1支第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第103页第二天接种选择性平板进行分离培养和玻片法血浆凝固酶试验1、血平板制备及兔血浆制备2、接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于血平板或B－P平板。3、培养放于36±1℃培养24h。4、玻片法血浆凝固酶试验第三天观察分离结果、镜检和葡萄糖肉浸液肉汤制备及接种第四天血浆凝固酶试验（试管法）、试验汇报第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第104页第五节单核增生李斯特菌检验第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第105页李斯特氏菌属李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，最新分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovii）无害李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）

在李斯特氏菌属六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌能够引发老鼠和其它动物发病。不过，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类李斯特氏菌症（listeriosis）相关。所以，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第106页生物学特征

---菌体形态及染色特征革兰氏阳性；小、类似球形杆菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群细胞沿长轴方向平行排列，在较老或生长不良培养物中，可能形成丝状；20-25℃以4根周生鞭毛运动，在37℃只有较少鞭毛或1根鞭毛；无芽孢、无荚膜。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第107页第五章食品中微生物标准检验与分析技术食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第108页生物学特征

---培养特征兼性厌氧；在20--25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能迟缓生长），最适培养温度为35--37℃。pH范围pH4.4-pH9.6。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第109页生物学特征

---培养特征在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但伴随菌落增大，变得不透明。在5-7%血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，经过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第110页生物学特征

---生化反应触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵各种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第111页生物学特征

---血清型依据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株血清型普通为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第112页生物学特征

---抵抗力该菌对理化原因抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长久存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，最少15min）和干热灭菌（160-170℃，最少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第113页流行病学

分布：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中都有该菌存在，所以动物很轻易食入该菌，并经过口腔-粪便路径进行传输寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第114页流行病学

据报道，有1-10%人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%水产品、5-10%奶及其产品、30%以上肉制品及15%以上家禽均被该菌污染。相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生蔬菜、发酵过生肉制作香肠、生和加工过禽肉、各种生肉类、生和烟熏鱼肉。约有85-90%病例是由被污染食品引发。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第115页1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收食品种类（起源：USDA及FDA汇报）食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第116页致病性及其治疗该病临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺点患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发烧、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。由该菌造成脑膜炎致死率可高达70%，败血症死亡率达50%，围产期或新生儿感染死亡率超出80%，怀孕期妇女感染，母亲通常能存活下来。抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第117页感染人群感染剂量未知，但与该菌毒力和易感人群年纪、免疫状态相关。易感者：孕妇/胎儿—围产期和新生儿感染；接收皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植治疗、艾滋病患者等免疫缺损者；癌症病人—尤其是白血病患者；不太常见报道—糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎患者；年纪较大人；没有免疫缺点健康人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌食品后，也有患病危险。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第118页致病机理单增李氏菌抗原结构与毒力无关，它致病性与毒力机理以下：1、寄生物介导细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内过氧物（为杀菌毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李氏杆菌素O，能够从培养物上清液中取得，有α和β两种，为毒力因子。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第119页试验室危害不是一个普遍与试验室相关传染病，当前只有少数有报道案例发生；直接摄取是最普遍一个感染方式，除此之外，暴露在该菌高浓度气溶胶中，也可经过眼睛和破损皮肤、粘膜进入体内造成感染。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第120页注意事项生物安全2级，操作时应有对应防污染设施，在进行可能产生气溶胶操作时，应在生物安全柜内完成；在直接接触有感染性材料时，必须穿着试验服，戴手套和护目镜；怀孕妇女应防止接触传染物。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第121页操作要求溅洒：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入1%次氯酸钠溶液，由周围向中心加，在清理之前要留充分接触时间（30min）；废弃：在废弃前应先采取净化办法，高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；储存：在有适当标识密封容器内储存。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第122页检测程序

---增菌当前惯用单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、Fraser肉汤（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第123页半量Fraser肉汤和Fraser肉汤含有选择性和区分性。加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区分作用。李斯特氏菌能够水解七叶灵，与培养基中铁离子反应，使培养基变黑，可直观从培养液颜色就能够判断是否有单核李斯特氏菌生长。氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用添加剂一样半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/LFraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄25mg/L食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第124页UVMUVM只有选择性没有区分性加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因子。即使其中含有七叶灵，不过没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色颜色反应。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第125页LEB和BLEB只有选择性没有区分性LEB是在TSB-YE基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入丙酮酸钠，有利于受损细胞恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第126页检测程序

---分离分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首选依然是OXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌含有β－D－葡萄糖苷酶活性，能水解培养基中七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是检测由毒力基因编码溶血素，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而能够很好将此两种菌同李斯特属其它种分开。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第127页OXA平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培养食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第128页OXA平板无害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培养食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第129页检测程序

---判定蓝色菌落检验（Henryillumination）经典运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头动力试验：7天，伞形生长过氧化氢酶试验：阳性革兰氏染色：阳性短杆菌溶血试验：穿刺接种血平板硝酸盐还原试验：5天，阴性糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其它种甘露醇阴性，木糖和鼠李糖最有检测意义食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第130页动力试验食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第131页血平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培养食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第132页血平板无害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培养食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第133页

血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培养食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第134页单核增生李斯特氏菌检测流程25g样品+225mlBLEB基础（加入丙酮酸钠）

加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮

30℃4hr划线接种OXA平板30℃

24hr和48hr

科玛嘉李氏菌显色培养基TSA-YE分纯

35℃

24hr-48hr

35℃

24hr过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃

24-48hr汇报结果35℃18-24hr食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第135页方法名称一次增菌二次增菌分离判定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）蓝色菌落；经典运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*无未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、经典运动）；生化特征（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同溶血无LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三种抑菌剂（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七叶灵+Fe3+推荐BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria蓝色菌落*；经典运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验*筛选、判定都能够使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步判定：纯菌菌落形态；经典运动；生化判定：MICRO-ID®Listeria或Api®Listeria或BAM等方法中传统生化反应；协同溶血遗传判定：核糖体RNA检测；PFGE*筛选取快速方法必须经过确认后才可使用判定中用到MICRO-ID®、Api®、GenProbeAccuProbe®、GENE-TRAK®各官方方法比较食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第136页各官方方法比较方法名称一次增菌二次增菌分离判定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM经典运动或动力试验；溶血试验；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速判定试剂盒*；过氧化氢酶*；革兰氏染色*；协同溶血*；血清学试验*作为判定可选步骤，允许使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe™ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉汤（30℃，24±2h）Fraser肉汤（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧条件培养蓝色菌落*；过氧化氢酶；革兰氏染色；动力试验或经典运动*；溶血试验；糖发酵试验；协同溶血；送参考试验室（血清或噬菌体分型）无NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉汤（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；经典运动动力试验；糖发酵试验；送参考试验室（血清、噬菌体、DNA或酶分型）允许使用经过确认商业化生产单核增生李斯特氏菌菌株判定试验，但没列明详细试剂盒名称食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第137页第七节食品中副溶血性弧菌检验食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第138页一、概况

副溶血性弧菌（V。parahemolyticus）于1950年从日本一次暴发性食物中毒中分离发觉。该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中。依据菌体O抗原不一样，现已经有13个血清群。主要引发食物中毒，尤以日本、东南亚、美国及我国台北地域多见，也是我国大陆沿海地域食物中毒中最常见一个病原菌。本菌广泛存在于海水中，偶亦见淡水。在海水中能存活47日以上，淡水中生存1～2日。在37℃、pH7.7、含氯化钠3～4%环境中生长最好。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖快速，每8～9分钟为1周期，低于0.5%或高于8%盐水中停顿生长。对酸敏感，在2%醋酸中或50%食醋中1分钟即可死亡。不耐热，56℃、5分钟即可杀死，90℃、1分钟灭活。对低温及高浓度氯代钠抵抗力甚强。

食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第139页当前已发觉本菌有12种菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型。从患者粪便分离出菌株属于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，自致病食物分离菌株90%以上属于Ⅳ、Ⅴ型。致病性菌株能溶解人及家兔红细胞，称为“神奈川”试验（kanagawatest）阳性。其致病力与其溶血能力平行，这是由一个不耐热溶血素（分子量4）所致。本菌能否产生肠毒素尚待证实。媒介食品副溶广泛存在于海岸和海水中，海生动植物常会受到污染而带菌。海鱼、虾、蟹、蛤等海产品带菌率极高；被海水污染食物、一些地域淡水产品如鲫鱼、鲤鱼等及被污染其它含盐量较高食物如咸菜、咸肉、咸蛋亦可带菌，也可因受到污染而引发中毒。带用少许该菌食物，在适宜温度下，经3～4小时细菌可急剧增加至中毒数量。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引发。临床表现潜伏期多为10小时左右，普通8～40小时，主要症状有恶心、呕吐、上腹部阵发性猛烈腹痛、频繁腹泻、洗肉水样或带粘液便，无里急后重，每日5～6次，体温39℃。重症病人可有脱水、血压下降、意识不清等。病程2～4天，普通预后良好，无后遗症，少数病人因休克、昏迷而死亡.食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第140页二、生物学特征（一）形态与染色

1、革兰氏阴性无芽胞多形态杆菌，单端鞭毛、两端浓染。杆状、棒状、甚至球状、丝状等食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第141页（二）培养特征：1、需氧或兼性厌氧：生长最好2、在2～３%NaCL培养基中生长最好，无盐或食盐>10%不能生长。3、最适温度36℃，PH7.5—7.8（7.7）4、在专用选择性平板上，菌落呈圆形凸起，混浊不透明，表面光滑，较湿润，边缘不整齐。5、血平板：可见溶血环。

食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第142页（三）生化特征

1、分解GLU产酸不产气，不分解乳糖，蔗糖。2、H2S（－）、V-P（－）、靛基质（－）、精氨酸（－）3、甲基红（＋）、赖氨酸（＋）、溶血＋/-食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第143页（四）抗原结构：O抗原O1—O1313个群。H抗原：K抗原：K1—K7065个型缺：K2K14K17K35K62食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第144页三、检验操作关键点

采样→样品处理→增菌培养→分离培养→3.5%氯化钠三糖铁培养基→嗜盐性试验→生化判定→动物试验→结果汇报食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第145页1、采样：患者粪便、呕吐物、可凝食品。从海产品体表面，肠内容物，鳃等取样包装物，炊具用具。快，不宜低温保留。2、增菌培养：Nacl结晶紫增菌液，37℃8～16小时。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第146页3、分离培养：Nacl蔗糖平板：圆形，半透明或不透明，无粘性，(绿)兰色，直径2—4mm

嗜盐选择性平板：直径2.5mm，圆整或不齐，隆起混浊，无粘性，无色，湿润。4、3.5%Nacl-TSI培养37℃24小时5、镜检：应为革兰氏阴性，无芽胞多形态，两端浓染。食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第147页食品中微生物标准检验和分析技术专家讲座第148页6、嗜盐性试验：