病毒接种、收获尿囊液操作步骤

病毒接种选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象的鸡胚。标记注射点：接着用记号笔在气室上方约1mm处画线，在线的下方挑选注射点，在挑选注射点时应注意避开主血管，避开鸡头。打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒，用打孔器在气室线上方打孔。注意:孔不宜过大，否则会导致封蜡不完全，甚至将蜡油流进鸡胚内部。注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液，注射时针头朝向注射点方向，每次注射停留4~6s。封蜡：注射完毕，用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡。培养：将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养。孵化箱温度设置33~35C，湿度50%~70%,甲型流感病毒培养48~52小时，乙型流感病毒培养66~72小时。需准备的仪器试剂：手电筒，记号笔，碘酊，棉签，量筒（稀释），酒精灯，废液瓶，打孔器，三脚架，蜡块，连续注射器，一次性注射器，移液枪，移液枪枪头，镊子，纱布，打火机，蓝盖瓶注意事项：（1）、前一天将病毒原液拿至4P冷库；（2）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌；收获尿囊液鸡胚消毒:将培养好的鸡胚放入4C冷库进行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1~2分钟。接着，在鸡胚的气室z.用碘酊消毒。烙蛋：将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋。收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头，同时用5ml移液枪吸取尿囊液。收获的尿囊液应是澄清、微黄状。保存：将收获的尿囊液放至6C冷库保存。需准备的仪器试剂：新洁而灭溶液，碘酊，棉签，烙蛋器，废液瓶，镊子，5ml移液枪，5ml移液枪枪头，蓝盖瓶(数量由病毒原液体积决定)。注意事项：、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌；血凝滴度试验稀释病毒液：取一块洁净的96”孔血凝板，横向摆放。用微量移液器(20—2ul)加入磷酸盐缓冲液1ul至第一孔，横向从第二孔开始，每孔均用微量移液器(5—50ul)加入磷酸盐缓冲液25ul直至第十二孔。倍比稀释：在U”型96孔血凝板的左侧标记样品名称，用微量移液器(5—50ul)从第一孔内加入25ul病毒悬浮液吹打混匀，将病毒液稀释五倍。取出25ul放到第二孔中，从第二孔开始倍比稀释，每孔吹打混匀，稀释到最后一孔弃掉25ul，此时的稀释倍数为1:10240。阴性对照：在同一块U”型6孔血凝板的最后一排，后三孔用25ul的磷酸盐缓冲液替代供试品，作为阴性对照。加鸡血：将1%鸡红细胞悬液倒入加样槽吹打混匀，开始从第十二列至第一列每孔均用微量移液器(5-50以)加入25以的1%鸡红细胞悬液，振荡均匀z.后置室温40分钟后观察结果。结果计算：观察阴性对照，若红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，可见红细胞滑动呈泪滴状为“-”，则阴性对照成立。按照《流感病毒血凝滴度检测标准操作规程》观察每孔凝集状态，结果以++”（++以数字2代之）为终点，以红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++”亦即一个凝集单位，也就是说最高稀释度病毒能引起+牛”号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度简称血凝滴度。影响血凝抑制实验的因素红细胞悬液浓度：来源于不同个体鸡的红细胞，对抗原的敏感性不尽相同。因此实验时最好用3-4只未免疫鸡。配制红细胞时，红细胞浓度低，HI滴度就会下降；红细胞浓度高，HI滴度就会上升。有实验表明，红细胞浓度增加一倍，HI滴度就会上升，因此，红细胞浓度以1%为宜。抗原的稀释倍数：配制抗原时，浓度必须准确。当抗原浓度高时，皿【抗体效价就下降；当抗原浓度抵时，^【抗体效价就上升。实验用的稀释液仲日$）:稀释液的pH值对实验有影响。稀释液的「日值5.8以下，红细胞容易产生自凝现象；pH值在7.8以上凝集图形易消失，也会造成实验误差。而pH值为7.0时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HI效价也最高，因此实验时用的稀释液。实验时的温度：实验时的温度，从4-37°C，随着温度上升，HA与HI滴度提高,但在37T时，凝集的红细胞易洗脱；4。。以下红细胞易产生自凝，故操作常用18-22C。（以上所阐述的是实验室操作过程中存在的几点因素，在实际工作中，也存在着其他诸多原因，如采样的时间、采样的数量、以及由疫苗产生的影响等。）流感病毒裂解疫苗生产工艺流程相关参数z.工艺流程相关参数接种注射0.2ml/枚收获收获8~10ml/枚离心澄清1rpm，1020min平板过滤0.45um超滤浓缩3KD蔗糖密度梯度