第1.1节：DNA重组技术的基本工具

第1.1节DNA重组技术的基本工具专题一：基因工程基因工程的产物：多彩小鱼转基因小鼠转基因小猪辣椒香蕉蓝色玫瑰黑籽番茄蓝色妖姬基因工程的产物：蓝色妖姬的产生蓝色素基因三色紫罗兰白玫瑰导入知新目的基因受体细胞技术：基因工程基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因工程的别名__________________操作环境生物体外操作对象____________操作水平__________________操作过程__________________实质____________结果DNA重组技术/基因拼接技术基因DNA分子水平基因重组剪切→拼接→导入→表达新的生物类型和生物产品科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论达尔文提出生物进化论科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律早期基础理论科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。早期基础理论科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程艾弗里证明DNA是主要遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。早期基础理论科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。早期基础理论科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制早期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论科技探索之路：技术发明使基因工程的实施成为可能1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。普通棉花抗虫棉想一想：完成抗虫棉的培育，需要哪些关键工作？基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花有抗虫特性苏云金芽孢杆菌转基因棉花产生伴胞晶体思考：在以上过程中关键步骤或难点是什么？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子手术刀”——“分子缝合针”——“分子运输车”——限制性核酸内切酶DNA连接酶载体DNA重组技术的基本工具(1)“分子手术刀”——(2)“分子缝合针”——(3)“分子运输车”——

DNA连接酶基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具1．来源：2．特点：3．作用：4．结果：主要是从

中分离纯化出来的。原核生物识别双链DNA分子的某种________________。切割特定核苷酸序列中的特定位点。具有专一性。特定核苷酸序列断开每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________（化学键）。磷酸二酯键产生______末端或____末端。黏性平(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具1’2’3’4’5’复习：脱氧核苷酸的结构(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具复习：磷酸二酯键G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具限制酶的识别序列24仔细观察各限制酶的识别序列有何特点？限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列

不同的限制性内切酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列。(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。例如：EcoRⅠ内切酶(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具

黏性末端黏性末端

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。例如：EcoRⅠ内切酶(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具例如：SmaⅠ内切酶SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线在G与C之间切割(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA重组技术的基本工具例如：SmaⅠ内切酶平末端平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。DNA重组技术的基本工具(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。DNA重组技术的基本工具(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。DNA重组技术的基本工具(1)、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”酶作用限制酶DNA水解酶DNA解旋酶限制性内切酶与DNA水解酶、DNA解旋酶的区别将DNA两条链的氢键打开形成两条单链切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核糖核苷酸。DNA重组技术的基本工具(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”

把被限制酶切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将两个脱氧核糖核苷酸连接起来催化形成磷酸二酯键。1．作用：DNA重组技术的基本工具(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”

把被限制酶切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将两个脱氧核糖核苷酸连接起来催化形成磷酸二酯键。1．作用：

两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来例如：E·coliDNA连接酶DNA重组技术的基本工具(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”2．种类：大肠杆菌互补的黏性末端噬菌体黏性末端平末端连接平末端需要用什么连接酶？T4DNA连接酶DNA重组技术的基本工具(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”E.coliDNA连接酶：只能连接黏性末端之间。T4DNA连接酶：既连接黏性末端，又连接平末端。例如：T4DNA连接酶DNA重组技术的基本工具(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”形成重组DNA分子。3．结果：……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合（E.coliDNA连接酶）同一种内切酶（EcoRⅠ内切酶）……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……DNA重组技术的基本工具(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”限制酶与DNA连接酶的关系：

①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。②DNA连接酶起作用时不需要模板。DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：DNA重组技术的基本工具DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键

在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键(2)、DNA连接酶——“分子缝合针”DNA重组技术的基本工具(3)、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。1.载体的作用：(目的基因)(宿主细胞)DNA重组技术的基本工具(3)、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”2.作为载体必须具备的条件：①具有一个或多个限制酶切割位点，以便目的基因可以插入，而且该切割位点必须位于载体本身必需的基因序列之外。，这样才不至于因目的基因的插入而失活。②能够自我复制或整合到染色体DNA上后随染色体DNA复制。③带有标记基因，便于筛选。

④本身是安全的，不能对受体细胞产生危害。⑤大小适中，便于操作。DNA重组技术的基本工具(3)、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.载体的种类：

①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子；②λ噬菌体的衍生物；③动植物病毒。DNA重组技术的基本工具(3)、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”基因工程中最常用的载体——质粒1．来源：质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物中。2．结构：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子，如图所示：3．标记基因：质粒上有一些特殊的基因，如抗四环素基因、抗氨苄青霉素基因，用于对重组DNA进行鉴定和选择。

实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。DNA重组技术的基本工具(3)、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”提醒:细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别

细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物,也可能是生物，如动植物病毒等。化学本质不同：功能不同：

细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把目的基因导入受体细胞。

(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。

(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。

(3)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，为了得到互补的末端。只有互补关系的两个末端才可连接。DNA重组技术的基本工具[关键一点]课堂总结基因工程的别名__________________操作环境操作对象____________操作水平__________________操作过程__________________实质____________结果DNA重组技术/基因拼接技术基因DNA分子水平基因重组剪切→拼接→导入→表达1、基因工程：2、基因工程的基本工具：(1)“分子手术刀”——________(2)“分子缝合针”——________(3)“分子运输车”——________DNA连接酶基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶生物体外新的生物类型和生物产品3、与DNA分子相关酶的比较1、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是（）A、①②

B、①③

C、①④D、②③2、下列哪一种酶是基因工程的工具酶（）

A、DNA连接酶B、DNA酶

C、RNA酶D、运载体课堂练习3、下列有关DNA连接酶的叙述正确的是()A．T4DNA连