第三章糖和苷类

湖北医药学院药学院Wednesday,February1,2023王纠zhiziangel@163.com第三章糖和苷类化合物本章基本内容

一、概述二、糖和苷的结构与分类三、糖和苷的理化性质四、糖和苷的提取与分离五、糖和苷的检识六、苷结构的研究2苷的提取与分离苷的检识苷的结构研究

第三讲3掌握：苷的分类提取及其常用分离方法熟悉：苷的结构研究方法。了解：苷的检识方法41、提取：四、苷的提取分离5苷的种类不同，性质不同，提取分离方法也不同苷：极性随着糖基的增多而增大。糖基增多，苷元所占比例相应变小，亲水性增大。苷元：一般可溶于低极性有机溶剂。6

原生苷：先要设法抑制或破坏酶的活性,常用的方法是采用甲醇、乙醇或沸水提取,或在药材中拌入CaCO3,

在提取过程中要尽量避免与酸或碱接触，以防苷类被酸或碱水解次生苷：可利用发酵、酶解、酸碱水解等方法处理药材，选择性部分水解以提高目标物产量。提取前将药材粗粉加适量水拌匀，加热至35℃左右保持24～48小时，再用有机溶剂（醇、苯、氯仿、石油醚）进行提取7提取苷元时，先用适当方法彻底水解苷类（酶解或酸水解），再用乙酸乙酯、氯仿、石油醚等极性小的有机溶剂提出苷元；也可先提取总苷，再水解成苷元例如：大豆苷元（葛根）提取苷应注意问题1)破坏酶的活性:2)注意酸碱条件防止苷水解3)根据需要采取不同方法提取苷苷元——酸水解原生苷——防止水解次生苷——酶解880℃以上加热60％以上醇提取加入CaCO3后沸水煮苷类的提取和分离流程(系统溶剂提取法)9水沉水层先用水饱和经初步提取得到的苷类通常极性较大，且多为非结晶性物质，同时不同程度地混有其他物质，分离困难，一般需先除去杂质，再进一步分离纯化。

除杂：可用溶剂沉淀法，也可用大孔树脂吸附法来富集、纯化总苷。2、分离10粗提物溶于少量甲醇或水，加丙酮或乙醚使较纯的苷类沉淀析出粗提物溶于水,上大孔树脂柱,先用水洗去无机盐、糖、多肽等杂质,再用逐步增加浓度的稀醇洗脱苷类分离：综合应用各种色谱法硅胶：多用氯仿-甲醇系统洗脱。

（常用，适用大多数苷）反相硅胶：水-甲醇或水-乙腈系统。（皂苷、某些亲水性苷）凝胶：SephadexLH-20、SephadexG系列。水-醇系统洗脱。（适于分子量不同的苷类，如蒽醌、二蒽酮类）大孔树脂、活性炭、纤维素、聚酰胺、离子交换树脂等大孔树脂法、溶剂法等通常可除掉其他杂质，获得总苷；柱色谱法可得到单体化合物11物理吸附：

分子间力，无选择性，可逆。

硅胶、氧化铝、活性炭化学吸附：化学键，选择性较强，常不可逆。

硅胶——生物碱碱性氧化铝——黄酮、蒽醌等半化学吸附：氢键，选择性较弱，多可逆

聚酰胺根据物质吸附性差异进行分离12物理吸附的基本规律：极性相似者易于吸附非极性吸附剂：活性炭对非极性成分吸附强溶剂极性吸附剂对溶质的吸附力溶质可被极性弱的溶剂洗脱极性吸附剂：硅胶、氧化铝对极性物质亲和力强溶剂极性吸附剂对溶质的吸附力溶质可被极性强的溶剂洗脱13

一般物质：官能团的种类、数目、位置、碳链长短

R-COOH﹥Ar-OH﹥R-OH﹥R-NH-﹥R-CO-NH-﹥R-CHO﹥R-CO-R﹥R-COO-R﹥R-O-R﹥R-X﹥R-H溶剂：介电常数ε，极性

环己烷（1.88）苯（2.29）无水乙醚（4.47）氯仿（5.20）乙酸乙酯（6.11）乙醇（26.0）甲醇（31.2）水（81.0）极性及强弱判断

14活性炭吸附法结晶、重结晶中脱色、脱臭从大量稀水液中浓缩微量物质1）简单吸附法用于物质的浓缩与精制15硅胶吸附柱色谱氧化铝吸附柱色谱

A．吸附剂：30～60倍，有时100～200倍

B．装柱：径高比（d/h）1:15～1:20

干法装柱/湿法装柱

C．上样：干法上样/湿法上样

D．洗脱：等度/梯度（洗脱剂极性递增）

E．托尾：化学吸附：硅胶—碱性成分洗脱剂中加入碱氧化铝—酸性成分洗脱剂中加入酸

F．洗脱系统的选择：TLCRf=0.2～0.32）吸附柱色谱法16高分子聚合物不溶于常见有机溶剂对碱稳定对酸特别是无机酸稳定性差可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸中性质3）聚酰胺柱色谱

17分子间氢键——半化学吸附吸附原理18化合物在含水溶剂中大致有以下规律：形成氢键的基团数目：越多，越强。形成氢键的基团所处的位置：处于易形成分子内氢键者，减弱。分子中芳香化程度：高，增强。影响吸附力的因素1920各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力水甲醇乙醇氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液影响吸附力强弱的因素化合物在不同溶剂中的吸附力，随溶剂极性增强而增强水中最强———常以水装柱、样品以水溶解上样含水醇中次之醇中最弱———常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱

EtOH-H2O最常用

弱强21醌类、黄酮类等酚性的制备和分离。脱鞣处理生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离也有用途应用22高分子聚合物白色球形颗粒多孔网状结构不溶于酸、碱、有机溶剂吸附原理：分子间力、氢键分子筛性质原理4）大孔吸附树脂

23树脂的性质：非极性树脂易吸附非极性化合物极性树脂易吸附极性化合物溶剂的性质：物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小影响吸附力强弱的因素24水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。最常用：乙醇—水广泛应用于化合物的分离与富集工作中如：苷类、糖类的分离生物碱的精制多糖、黄酮、三萜类化合物的分离。洗脱剂应用25根据物质分子大小差异进行分离透析法超滤法超速离心凝胶滤过法gelfiltration：凝胶渗透色谱gelpermeationchromtography

分子筛滤过molecularsievefiltration26凝胶三维网状结构的分子筛作用按分子量由大到小的顺序分离原理凝胶滤过法gelfiltration：葡聚糖凝胶SephadexG：葡聚糖+交联剂（环氧氯丙烷）分子筛水中应用分离水溶性成份商品型号按交联度分类，以10倍吸水量（ml/g）表示羟丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20:

SephadexG-25羟丙基化所得分子筛和反相色谱相结合水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中使用水溶性、脂溶性成分都可分凝胶的种类、性质及应用28根据物质离解程度不同分离进行分离——离子交换法离子交换树脂为固定相，水，含水溶剂装柱含水流动相通过树脂可交换离子与树脂上的交换基团交换，吸附到树脂上中性及无交换离子的成分流出将吸附到柱上的成分洗脱下来离子交换原理29球形颗粒，不溶于水，可在水中溶胀离子交换树脂的性质离子交换树脂的结构母核离子交换基团30离子交换树脂的种类阳离子交换树脂：强酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂：强碱性（-N+（CH3）3Cl-）弱碱性（-NH2，-NH-，-N=）31离子交换树脂的应用不同电荷离子的分离如水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离相同电荷但解离程度不同离子的分离如碱性不同的生物碱的分离32水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离33

ⅠⅡ

碱性Ⅰ＜Ⅱ＜

ⅢⅢⅡⅠ碱性不同的生物碱的分离34苷的检识:苷由糖和苷元组成，含有糖基是苷类的共性。因此，其共性检识的方法是检识分子中是否含有糖，这和糖类的检识类似。其苷元部分的检识将在相应的章节中介绍。糖的检识:主要是利用糖的还原性和糖的脱水反应所生成沉淀、产生的颜色变化等现象来进行理化检识，色谱检识则利用薄层色谱和纸色谱等方法进行。五、苷的检识351、菲林反应和多伦反应：仅还原糖反应阳性，非还原糖和苷类反应阴性。2、Molish反应注意：单糖、低聚糖、多糖、苷类，Molish反应均为阳性丙酮、甲酸、乳酸、草酸、没食子酸、苯三酚、α-萘酚和葡萄糖醛酸以及各种醛糖衍生物Molish反应也为阳性排除检识反应过程中水解产生的游离糖的干扰排除游离糖的干扰（正丁醇萃取苷类）氨基糖反应阴性，碳苷和糖醛酸苷有时呈阴性（一）理化检识3637方法取样品的提取液1ml，加5%α-萘酚乙醇液1～3滴，摇匀后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，若在两液面间有紫色环产生，说明样品组成中含有糖或苷类。样品提取液紫色环浓硫酸α-萘酚乙醇水提取液水液正丁醇液供试品呈阳性萃取正丁醇蒸干Molish反应苷类单糖、低聚糖、多糖苷类38水提取液往往含有大量的单糖、低聚糖、多糖等，难以直接检识苷类，可用正丁醇萃取，正丁醇萃取液蒸去溶剂后进行Molish反应，如呈阳性则表明含有苷类。39样品滤液菲林反应多糖反应液呈阳性Molish反应过滤苷类乙醇溶解不溶物氧化亚铜沉淀游离糖因浓硫酸可将结合糖水解为游离糖，Molish反应阳性仅能说明样品中含有游离或结合的糖，却不能判定是苷类还是游离糖或其他形式的糖样品酸水解后放冷的反应液出现沉淀，则存在苷类化合物。因为苷类在酸水中水解产生糖和苷元，苷元一般具有亲脂性，水溶性差，易在水解液中析出沉淀。

多糖和低聚糖水解后产生单糖水溶性好，不会产生沉淀。403、水解反应：1、薄层色谱

1)硅胶板

2)展开剂：正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5上层），乙酸乙酯-正丁醇-水（4：5：1上层），氯仿-甲醇-水（65：35：10下层）等含水系统

3)显色剂：硫酸、茴香醛硫酸、苯胺-邻苯二甲酸等

4)硅胶用0.03mol/L硼酸溶液或无机盐水溶液代替水涂布薄层，能增加糖在固定相中的溶解度，样品承载量明显增加。

（二）色谱检识412、纸色谱

展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5上层，BAW)，正丁醇-乙醇-水(4：2：1)，水饱和的苯酚。

显色剂：苯胺-邻苯二甲酸、间苯二酚-盐酸等。42问题：纸色谱中以BAW和正丁醇作展开剂，展开糖，谁的Rf值大？（一）物理常数测定：如熔点、比旋度、溶解度等。（二）分子量和分子式的测定经典方法：元素分析，分子量测定。现代方法：质谱法（MS，massspectrum）

六、苷的结构研究43确定分子量、分子式提供部分结构信息

——丢失碎片的大小如15、17

——碎片的m/z及裂解方式（三）组成苷的苷元和糖的鉴定苷用稀酸或酶进行水解——单糖和苷元，再鉴定。1、苷元的结构鉴定根据化学性质判断类型和母核结构。（IR、UV）2、苷中组成糖的种类鉴定常采用PC、TLC、GC对糖进行鉴定，也可通过NMR进行鉴定。3、苷中糖的数目的测定44（五）糖和糖之间连接顺序的确定45（六）苷键构型的确定（α或β构型）1、利用酶水解进行测定2、利用NMR确定苷键构型3、利用klyne经验公式进行测定1、部分水解法2、利用NMR确定（四）苷分子中苷元和糖，糖和糖之间连接位置的确定1、苷元与糖分子之间连接位置的确定：13CNMR法（苷化位移）2、糖与糖之间连接位置的确定：乙酰解、甲醇解法、NMR法常用质谱技术及特点电子轰击质谱（EI-MS，electronimpactionization）场解析质谱（FD-MS，fielddesorptionionization）快速原子轰击质谱（FAB-MS，fastatombombardment）电喷雾质谱（ESI-MS，electrosprayionization）化学电离质谱（CI-MS）高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MS）46样品需加热气化，离化，得到M+难气化、易热解的成份测不到M+

如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素电子轰击质谱（EI-MS）场解析质谱（FD-MS）试样稀液涂于钨丝上作阳极，对面加阴极，通高压，使电离难气化、易热解的成份，可得到分子离子相关峰：[M＋H]+、[M＋Na]+、[M＋K]+

逐个脱去糖基的碎片峰：[M＋H-162]+、[M＋H-162-146]+苷元的碎片离子相对少47离子枪发射高能离子与另一中性粒子碰撞，交换电荷，

形成高速中性粒子，与样品碰撞，使其电离难气化、易热解的成份，可得到分子离子相关峰：[M＋H]+、[M＋Na]+、[M＋K]+

逐个脱去糖基的碎片峰：[M＋H-162]+、[M＋H-162-146]+

可得到苷元的碎片快速原子轰击质谱（FAB-MS）分子量及M-1、M-H2O等裂解碎片的精确质量高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MS）483、苷中糖的数目的测定经典：利用PC或TLC法鉴定种类，再用光密度扫描测定单糖斑点含量，算出各糖的分子比，推测成苷的糖的数目。现代：利用质谱（MS）测定苷和苷元的分子量—计算差值—求出糖数目。根据1H-NMR谱中端基碳质子信号（δ4.3~6.0ppm）推算糖数目。

利用13C-NMR谱糖的端基碳信号（δ90~112ppm）或根据苷的总C信号与苷元C信号数目推算。1H—1HCOSY，1H—13CCOSY等二维谱推算糖数目。49原理：1H、13C等具有磁矩的原子在外加磁场中受电磁波照射，吸收一定能量电磁波，产生能级变化，引起核磁共振氢核磁共振（1H-NMR）碳核磁共振谱（13C-NMR）二维核磁共振谱（2D-NMR）核磁共振（nuclearmagneticresonance,NMR）50氢核磁共振（1H-NMR）

应用：提供H的类型、数目、相邻原子团的信息

四个参数：化学位移（）：1～10～20ppm——H的类型屏蔽效应积分值/积分面积———同一环境下H的个数自旋偶合裂分的峰数———邻位与其不等同的H的个数符合n+1律s,d,t,q偶合常数（J）

———H核间的距离相隔键数：越少，J大，通常为3JH-H

二面角：越接近90°，J越小；越接近0°、180°，J越大

远程偶合(4JH-H)：邻位偶合常数：与两面角有关两面角90度J=0Hz；两面角0或180度J=6～8Hz；两面角60度J=2～4Hz对于糖质子当2-H为直立键时，1位苷键的取向不同，1-H与2-H的两面角不同，偶合常数亦不同：1-H和2-H键为双直立键，φ=180，J=6～8Hz1-H为平伏键，2-H直立键，φ=60，J=2～4Hz

52

当2-H为平伏键的情况下，1-H无论处于平伏键还是直立键，与2-H的两面夹角均约60度，故不能用该法判断苷键构型。

六碳醛糖中C2构型与葡萄糖不一致的D-甘露糖的苷键，就不能用端基质子的偶合常数来判断其构型。β-D-甘露糖苷α-D-甘露糖苷53

Jac=1.6～2.0HzJbc=0～1.5Hz烯丙偶合芳环上的偶合Jab=6～10HzJac=1～3HzJad=0～1Hz54碳核磁共振谱（13C-NMR）最重要的参数：

化学位移：1～200ppm—C的类型13C的信号裂分

13C-NMR：异核偶合—1H-NMR：同核偶合偶合裂分峰数：—C的级别符合n+1律，s,d,t,q，有1JC-H

2JC-H

3JC-H55糖的1H-NMR特征

化学位移规律：甲基质子：~1.0ppm

特点：比较容易辨认用途：1、确定甲基五碳糖的个数2、确定糖的种类3、确定糖与糖、糖与苷元的连接位置56

端基质子：4.3~6.0ppm；其余部位的质子信号均在3.2-4.2左右

特点：比较容易辨认用途：1、确定糖基的个数2、确定糖基的种类3、2D-NMR谱上糖信号的归属57

其余质子信号：3.2~4.2ppm

特点:信号集中,难以解析

归属:往往需借助2D-NMR技术。5859端基质子：4.3~6.0ppm；其余部位的质子信号均在3.2-4.260甲基质子：~1.0ppm端基质子：4.3~6.0ppm；其余部位3.2-4.2糖上碳信号可分为几类，大致范围为：

CH3：18ppm甲基五碳糖的C6，一般有几个信号(扣除苷元中的甲基)可表示有几个甲基五碳糖存在。

CH2OH：62ppmC5或C6CHOH：70～85ppm糖氧环上的C2～C4-O-CH-O-：95～105ppm端基C，在此范围内有几个信号可视为有几种糖存在于糖链的重复单位中。

糖上-OCH3:65ppm糖的13CNMR特征61糖C-1C-2C-3C-4C-5C-6β-D-葡萄糖96.775.176.770.676.861.7α-D-葡萄糖92.972.573.870.672.361.6β-D-半乳糖97.372.973.869.776.062.2α-D-半乳糖93.269.470.270.371.462.062部分单糖分子的碳谱数据

经典方法：化学降解或酶解—产物现代方法：NMR法

2D-NMR谱中，HMBC（氢-碳远程相关）谱已成为确定苷元连接位置的主要方法。可以观察到糖的端基质子与苷元α-碳原子信号以及苷元α-碳原子上的质子与糖的端基碳信号的相关峰。13C-NMR谱是确定苷元与糖连接位置的有效方法(利用苷化位移规律，将苷与苷元的碳谱相比较即可鉴别)

63（四）苷元和糖，糖和糖之间连接位置的确定1、苷元与糖分子之间连接位置的确定苷化位移

概念：糖与苷元成苷后，苷元的α-C、β-C和糖的端基碳的化学位移值均发生了改变，这种改变称苷化位移。

作用：推测糖与苷元、糖与糖的连接位置以及碳氢信号的归属。

64醇羟基苷化引起α-碳原子向低场位移（4-10ppm），β-碳原子向高场位移（0.9-4.6ppm）；如：伯醇65酚羟基、羧基苷化引起α-碳原子均向高场位移，β-碳原子向低场位移，此外对位碳原子也向低场移动。（酚羟基苷化引起端基碳向低场位移、羧基使端基碳向高场位移）。如三萜类化合物—齐墩果酸：66（1）化学方法:将全甲基化苷进行甲醇解，鉴定（与对照品共色谱），未全甲醚化的单糖，游离羟基所在位置即糖与糖之间的连接位置。2、糖与糖之间连接位置的确定67以缓和酸水解和酶水解法最为常用。缓和酸水解多使用低浓度的无机强酸或中强度的有机酸(如草酸)进行水解，可使苷中的部分糖水解脱去。例如：

681）部分水解法结果分析：由于在水解产物中检出木糖，因此可以确定木糖连接在末端。开裂一部分苷键，保留另一部分苷键，分析水解产物中得到的乙酰化低聚糖，也可以确定糖的连接顺序。692）乙酰解法用乙酐-ZnCI2乙酰解后，TLC检出了单糖、四糖和三糖的乙酰化物，并与标准品对照进行鉴定，由此可推出苷分子中糖的连接方式。70甲基化的单糖，根据单糖的甲基化位置判断糖的连接位置。全甲基化甲醇解糖的端基半缩醛羟基甲基化713）先甲基化，再甲醇解将糖链全甲基化，然后水解苷键，用GC鉴定所获得的甲基化单糖，其中游离-OH的部位就是连结位置,全甲基化的单糖即为末端糖。此外，目前常使用13C-NMR方法，主要是通过归属各碳信号，以确定产生苷化位移的碳。苷化位移--要判断苷中两个糖的连接位置，可将该糖的碳谱数据与单糖比较，若内端糖的某碳原子向低场位移（4-7ppm)，而其邻碳又向高场位移（1-4ppm），那么该碳原子为连接糖的位置。2D-NMR谱中，HMBC（氢-碳远程相关）已成为确定苷元的连接位置的主要方法。73（2）波谱解析——NMR法EI-MS谱：全乙酰化、甲基化或三甲基硅醚化——衍生化的糖基离子峰。FD-MS谱或FAB-MS谱：各种不同解离程度的糖基碎片离子峰。如人参皂苷Rb2的FD-MS谱中[(M+Na)+-132]表明末端有阿拉伯糖。

[(M+Na)+-162]表明末端有葡萄糖。[(M+Na)+-294]表明葡萄糖-阿拉伯糖链。

74（3）MS法（五）糖和糖之间连接顺序的确定经典方法：化学降解或酶解—产物现代方法：NMR法

糖与糖相连，内侧糖连接糖的碳原子移向低场（δ4～7ppm），相邻碳原子移向高场（δ-1～-4ppm）75苷缓和酸水解、酶解乙酰解全甲基化甲醇解部分苷键断裂的裂解产物推断分析一般不同的水解酶可水解不同类型的苷键，如麦芽糖酶能水解α-苷键，苦杏仁酶可水解β-苷键。

76（六）苷键构型的确定（α或β构型）1、利用酶水解进行测定2、利用NMR确定苷键构型H-2为a键的糖葡萄糖、木糖、半乳糖等H-1为a键时：H-1和H-2为aa偶合，Jaa=6～9HzH-1为e键时：H-1和H-2为ae偶合，Jae=2～3Hz771H-NMR法是目前常用的比较准确的方法。78ａ-D-葡萄糖苷ａ-L-鼠李糖苷J1ˊ2=Jae=2～3HzJ1ˊ2=Jae=2Hz

β-D-葡萄糖苷β-L-鼠李糖苷

J1ˊ2=Jaa=6～9HzJ1ˊ2=Jae=2Hz78H-2为e键的糖鼠李糖、甘露糖等H-1为e键时：H-1和H-2为ee偶合，Jee=2～3HzH-1为a键时：H-1和H-2为ea偶合，Jea=2～