植物组织培养技术二

专题3植物组织培养技术思考1、原理:2、必要条件：植物细胞的全能性细胞离体一定的营养物质、激素和其他外界条件外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官植物组织培养技术3、细胞的全能性①定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因已分化的植物细胞，仍具有全能性③实例受精卵>生殖细胞>体细胞④全能性的比较:1）、培育无病毒植株2）、培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4)、基因工程中亦需到植物组织培养的方法4、植物组织培养的应用：3）、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题课题目标说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行菊花或其他植物的组织培养。课题重点与难点课题重点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。课题难点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。课题1：菊花的组织培养一、基础知识1、植物的组织培养（1）细胞的分化①概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程②过程：如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统③特点：（2）稳定性：细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的（3）全能性：已分化的细胞，仍具有发育的潜能（1）持久性：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果④结果：形成不同的细胞和组织2、植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素>生长素细胞分裂素<生长素再分化植物细胞培养脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体(也受到创伤)培养时,已停止分裂的细胞,又重新恢复分裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结构和功能,成为具有未分化特性的细胞。再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下,又可经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和芽,形成完整植株,这一过程叫作再分化。愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞菠萝的愈伤组组织愈伤组织2、影响植物物组织培养的的因素（1）植物材材料的选择烟草和胡萝卜卜的组织培养养较为容易枸杞愈伤组织织的芽诱导比比较难同一植物材料料的年龄、保保存时间的长长短会影响实实验结果菊花的组织培培养一般选择择未开花植株株的茎上部新新萌生的侧枝枝一般来说，容容易进行无性性繁殖的植物物，也容易进进行组织培养养，如芦荟、、豆瓣绿、秋秋海棠、月季季（2）不同的的离体组织和和细胞对营养养、环境等条条件的要求相相对特殊，需需配置不同的的培养基MS培养基主主要成分包括括：A、大量元素素:N、P、K、Ca、Mg、S等B、微量元素素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、、Mo、I、、Co等C、有机物:如氨基酸、、烟酸、肌醇醇、维生素，，蔗糖等D、植物激素素①常用的植物激激素：生长素素、细胞分裂裂素和赤霉素（3）植物激激素的影响使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞即分裂也分化同时使用分化频率高②生长素和细胞胞分裂素作用用生长素细胞分裂素：>有利于根的分分化生长素细胞分裂素：<有利于芽的分分化，抑制根根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织织生长③生长素和细胞胞分裂素同时时使用，用量量的比例对植植物细胞发育育方向的影响响（4）pH、、温度、光照照pH控制在5.8左右，，温度控制在在18－22。C,每日用日日光灯照射12h生长素细胞分裂素：<讨论：你能说说出各种营养养物质的作用用吗？同专题题2中微生物物培养基的配配方相比，MS培养基的的配方有哪些些明显的不同同？答：微量元素和大大量元素提供供植物细胞生生活所必需的的无机盐；蔗蔗糖提供碳源源，同时能够够维持细胞的的渗透压；甘甘氨酸、维生生素等物质主主要是为了满满足离体植物物细胞在正常常代谢途径受受到一定影响响后所产生的的特殊营养需需求。微生物培养基基以有机营养养为主。与微微生物的培养养不同，MS培养基则需需提供大量无无机营养，无无机盐混合物物包括植物生生长必须的大大量元素和微微量元素两大大类。植物组织培养养过程离体的植物器器官、组织、、细胞脱分化愈伤组织再分化芽根植物体组织培养实验验过程简图移栽制备MS固体体培养基外植体消毒接种培养养栽培培二、实验操作作移栽栽MS培养基的的配制操作步步骤（1）MS培培养基母液的的配制:MS培养基含含有十几种化化合物，配制制不方便也难难称量准确，，可将培养基基中的各种成成分扩大一定定倍数分别称称量，配成浓浓缩液，这种种浓缩液叫做做培养基母液液。(母液配配制见下表)（2）MS（1000mL）培养养基的配制:按比例分别取取适量各种成成分的母液，，加入烧杯，，称取蔗糖30g，琼脂脂7g，加水水并加热使琼琼脂溶解，按按照需要的浓浓度分别加入入激素，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl溶液调节节pH至5.8~6.0。将配好的的培养基迅速速分装至组培培瓶中，拧上上盖子，放入入灭菌锅121℃，灭菌菌20min。③培养基的分分装注：由于菊花花的茎段的组组织培养比较较容易，因此此不必添加植物物激素3、灭菌分装好的培养养基连同其他他器械一起进进行高压蒸汽灭菌菌植物组培具体体操作步骤（1）取材：：取菊花生长旺旺盛的嫩枝(外植体不能能太小，否则则会影响愈伤伤组织的形成成)。（2）消毒与与修剪外植体体：①流水冲洗后后,加少许洗洗衣粉刷洗,流水冲20分钟;②放入70﹪﹪酒精中摇动动2~3次,持续6~7秒,无菌水水冲洗2~3次，用无菌菌吸水纸吸干干;③放入质量分数数为0.1%氯化汞溶液液中浸泡1～～2分钟,无菌水冲洗洗2~3次，，无菌吸水纸纸吸干。（3）接种常用灭菌剂使使用浓度及效效果比较表植物组织培养养消毒与接种种示意图接种注意事项项①每接种一块块外植体前，，镊子需放入入体积分数为为75％的酒酒精溶液中消消毒一次，然然后在酒精灯灯火焰上烧一一遍，冷却后后再接种②外植体在培培养基中要分分布均匀，放放置外植体数数量根据锥形形瓶的大小确确定，一般胡胡萝卜3－4块，菊的茎茎或叶6－8块，也不要要太少，以充充分利用培养养基中的营养养成分和光照照条件③插入时应注注意方向，不不要倒插。茎茎段、茎尖基基部插入培养养基利于吸收收水分和养分分思考：你打算算做几组重复复？你打算设设置对照实验验吗？答：每每种材材料或或配方方至少少要做做一组组以上上的重重复。。设置置对照照实验验可以以取用用一个个经过过灭菌菌的装装有培培养基基的锥锥形瓶瓶，与与接种种操作作后的的锥形形瓶一一同培培养，，用以以说明明培养养基制制作合合格，，没有有被杂杂菌污污染。。（4））培养养1、愈愈伤组组织的的培养养从接种种外植植体到到出现现愈伤伤组织织需经经过2周时时间。。2周周之内内可以以看到到外植植体上上逐渐渐长出出乳白白色或或黄白白色的的瘤状状愈伤伤组织织。首次培培养愈愈伤组组织时时，见见不见见光因因不同同植物物而异异，菊菊花在在见光光条件件下愈愈伤组组织长长的更更快。。胡萝萝卜无无光才才长得得好。。2周后后，培培养基基成分分接近近耗尽尽，必必须更更换培培养基基，进进行继继代培培养，，约20d2、试试管苗苗的培培养当愈伤伤组织织长到到一定定大小小后，，可以以更换换培养养基，，进行行试管管苗培养（五））移栽栽1、打打开封封口膜膜2、清清洗转转移（六））栽培培3、移移栽材料的的移栽栽及温温室培培养：：炼苗：：先在在外界界环境境闭瓶瓶锻炼炼3天天，再再开瓶瓶锻炼炼3天天（以以培养养基上上开始始长出出菌为为宜））。移栽：：去净净培养养基，，可先先在灭灭过菌菌的珍珍珠岩岩或蛭蛭石上上培养养使根根系发发达再再转移移到土土壤中中。菊花炼炼苗菊花移移栽苗苗1、外外植体体带菌菌2、培培养基基及接接种器器具灭灭菌不不彻底底3、接接种操操作时时带入入4、环环境不不清洁洁植物组组培污污染途途径污染的的预防防措施施（一））防止止外植植体带带菌（二））保证证培养养基及及接种种器具具彻底底灭菌菌（三））操作作人员员严格格遵守守无菌菌操作作规程程（四））保证证接种种与培培养环环境清清洁1、培培养基基的灭灭菌（（高压压蒸汽汽灭菌菌）2、外外植体体的消消毒（（酒精精、氯氯化汞汞）3、接接种的的无菌菌操作作（酒酒精、、酒精精灯———灼灼烧））4、无无菌箱箱中的的培养养；5、移移栽到到消过过毒的的环境境中生生存一一段时时间。。思考：：在整整个操操作过过程中中，是是如何何来实实现无无菌环环境的？？组织培培养原理过程意义利用植植物细细胞的的全能能性快速繁繁殖，，培育育无毒毒植株株，培培育作作物新新品种种根芽植物体体离体植物器官、组织或细胞(脱分化)愈伤组织(再分化)植物组组织培培养小小结:操作条条件含有全全部营营养成成分的的培养养基、、一定定的温温度、、空气气、无无菌环环境、、适合合的PH、、适时时光照照等练习1.答答：植植物组组织培培养所所利用用的植植物材材料体体积小小、抗抗性差差，对对培养养条件件的要要求较较高。。用于于植物物组织织培养养的培培养基基同样样适合合于某某些微微生物物的生生长，，如一一些细细菌、、真菌菌等的的生长长。而而培养养物一一旦受受到微微生物物的污污染，，就会会导致致实验验前功功尽弃弃，因因此要要进行行严格格的无无菌操操作。。2.答答：外外植体体的生生理状状态是是成功功进行行组织织培养养的重重要条条件之之一。。生长长旺盛盛的嫩嫩枝生生理状状况好好，容容易诱诱导脱脱分化化和再再分化化。影响植植物组组织培培养的的影响响因素素及及注意意事项项影响植植物组组织培培养的的几个个因素素植物的的材料料培养基基植物激激素pH值值外界因因素（（温度度，光光照，，通气气状况况，材材料处处理等等）【注意意事项项】1、实实验所所使用用的器器材必必须要要严格格灭菌菌，注注意无无菌操操作，，避免免因染染菌导导致实实验失失败；；2、配配制贮贮存母母液时时，要要算好好各种种成分分逐次次加入入，等等第一一种成成分完完全溶溶解后后再加加入第第二种种成分分，切切忌““一锅锅煮””。有有机物物质和和铁盐盐溶液液配好好以后后要装装入棕棕色瓶瓶放入入电冰冰箱内内保存存，其其它两两种种种母液液可在在常温温下保保存但但最多多不能能超过过一个个月；；3、pH值值对培培养基基的硬硬度有有影响响，pH过过高培培养基基变硬硬，pH过过低培培养基基不能能凝固固，所所以要要调整整好培培养基基的pH值值；4、材材料脱脱毒时时不要要在酒酒精中中停留留过长长时间间，以以免材材料被被杀死死。5、所所有制制备好好的溶溶液和和试剂剂瓶上上都要要有标标签，，注上上名称称、浓浓度、、消毒毒与否否和制制备日日期。。组织培培养实实验室室设置置及设设备介介绍（1））实验验室设设置组织培培养实实验室室设置置简图图（2））组组培相相关设设备仪仪器介介绍电子天天平纯纯水水机酸度计计高高压灭灭菌锅锅干燥箱箱摇摇床超净工工作台台数数码码显微微镜数码显显微镜镜又叫叫视频频显微微镜，，它是是将显显微镜镜看到到的实实物图图像通通过数数模转转换，，使其其成像像在显显微镜镜自带带的屏屏幕上上或计计算机机上。。我我们可可以对对微观观领域域的研研究从从传统统的普普通的的双眼眼观察察到通通过显显示器器上再再现，，从而而提高高了工工作效效率。。培养养架架恒恒温温光光照照培培养养箱箱非洲洲菊菊雏菊菊金盏盏菊菊波斯斯菊菊百日日草草孔雀雀草草9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。20:01:2020:01:2020:011/1/20238:01:20PM11、以以我我独独沈沈久久，，愧愧君君相相见见频频。。。。1月-2320:01:2020:01Jan-2301-Jan-2312、故人江海海别，几度度隔山川。。。20:01:2020:01:2020:01Sunday,January1,202313、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。1月-231月-2320:01:2120:01:21January1,202314、他他乡乡生生白白发发，，旧旧国国见见青青山山。。。。01一一月月20238:01:21下下午午20:01:211月月-2315、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。。一月238:01下下午午1月-2320:01January1,202316、行动出成成果，工作作出财富。。。2023/1/120:01:2120:01:2101January202317、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。8:01:21下下午午8:01下下午午20:01:211月月-239、没有失失败，只只有暂时时停止成成功！。。1月-231月-23Sunday,January1,202310、很多事事情努力力了未必必有结果果，但是是不努力力却什么么改变也也没有。。。20:01:2120:01:2120:011/1/20238:01:21PM11、成功就是日日复一日那一一点点小小努努力的积累。。。1月-2320:01:2120:01Jan-2301-Jan-2312、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。20:01:2120:01:2120:01Sunday,January1,202313、不知知香积积寺，，数里里入云云峰。。。1月-231月-2320:01:2120:01:21January1,202314、意志坚坚强的人人能把世世界放在在手中像像泥块一一样任意意揉捏。。01一一月20238:01:21下午午20:01:211月-2315、楚塞三湘接接，荆门九派派通。。。一月238:01下下午1月-2320:01January1,202316、少年年十五五二十十时，，步行行夺得得胡马马骑。。。2023/1/120:01:2120:01:2101January202317、空空山山新新雨雨后后，，天天气气晚晚来来秋秋。。。。8:01:21下下