单克隆抗体与基因工程抗体的制备

单克隆抗体与基因工程抗体的制备

第一页，共七十页。抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)第二页，共七十页。杂交瘤技术的基本原理单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生二、单克隆抗体的纯化三、单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性基因工程抗体制备一、基因工程抗体种类二、原理三、重组抗原制备过程第三页，共七十页。基本概念抗原决定簇（抗原表位）细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).由一个B淋巴细胞增殖而成的细胞集团针对多种抗原决定簇的混合抗体由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体第四页，共七十页。杂交瘤技术的理论基础淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。第五页，共七十页。杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细

胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤

细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤

细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体第六页，共七十页。流程杂交瘤技术第七页，共七十页。不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞第八页，共七十页。动物：BALB/c小鼠7～12周龄20g～25g体重（二）免疫脾细胞第九页，共七十页。细胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫免疫小鼠第十页，共七十页。细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同第十一页，共七十页。骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)50%PEG1min内加完;10ml培养液终止反应融合方法第十二页，共七十页。SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～51ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置45秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7-14天，换用HT培养液细胞融合第十三页，共七十页。7～20天出现克隆HAT筛选挑克隆融合细胞的早期培养第十四页，共七十页。HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA杂交瘤细胞的选择性培养第十五页，共七十页。HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻第十六页，共七十页。杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力第十七页，共七十页。有限稀释法特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.5～1个细胞阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存第十八页，共七十页。单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。第十九页，共七十页。一、单克隆抗体的产生动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只体外培养法：中空纤维培养系统

单抗含量不高，牛血清Ab难以去除第二十页，共七十页。腹腔注射法第二十一页，共七十页。盐析沉淀亲和层析离子交换层析二、McAb的纯化第二十二页，共七十页。Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示

表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞

争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 单克隆抗体的性质鉴定第二十三页，共七十页。四、单克隆抗体的特性高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性（一）单克隆抗体的特性第二十四页，共七十页。优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗单克隆抗体的优点与局限性局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高第二十五页，共七十页。

McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低

稳定低高沉淀反应无有成本高低McAb与PcAb的比较第二十六页，共七十页。McAbandPcAb第二十七页，共七十页。基因工程抗体制备基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)

根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。第二十八页，共七十页。将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体一、人源化抗体第二十九页，共七十页。Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体

二、小分子抗体第三十页，共七十页。其它生物活性蛋白融合三、抗体融合蛋白第三十一页，共七十页。许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。四、双特异性抗体第三十二页，共七十页。定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性五、噬菌体抗体库技术第三十三页，共七十页。原理与操作技术基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。第三十四页，共七十页。基因工程的操作技术

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、体外基因重组

目的基因的制备

载体的构建：质粒或噬菌体

目的基因与载体重组2、重组体DNA的转化增殖和表达

转化

筛选

增殖和基因表达第三十五页，共七十页。PCR(聚合酶链式反应)第三十六页，共七十页。

PCR技术原理示意图

靶序列变性和引物复姓循环1循环2循环3变性和引物复姓链延伸Tag酶链延伸第三十七页，共七十页。抗原的原核表达以脂肪酸结合蛋白（FABP）为例：首先要合成或购买表达FABP的基因序列并设计合成引物第三十八页，共七十页。ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATGGAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACCACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCTGACACTCACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGCATGA上游引物：HF1>5’CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC3’>

下游引物：HF2>5’GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT3’>

基因序列酶切位点第三十九页，共七十页。NdeIXbaICA

T

A

T

GG

T

A

T

ACTCT

A

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AA

G

A

TCTT

A

T

G

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G

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TCCAG

T

A

T

CT

A

G

A

T限制性内切酶限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应。第四十页，共七十页。通过扩增获取足够的联结片段PCR扩增第四十一页，共七十页。实验步骤去离子水缓冲液dNTP引物模板DNA聚合酶混匀1、按下列体系配制反应混合液，混匀，

TemplatecDNA

5.0μL10×buffer

2.5μLMgCl2（25mmol/L）

1.0μLPrimer1(10μmol/L)

0.5μLPrimer2(10μmol/L)

0.5μLdNTP（2mmol/L）

2.0μLTaq酶（5U/μL）

0.25μL加ddH2O至

50μL2、PCR反应循环条件设置

94℃变性反应1min；55℃退火反应45s；72℃延伸反应1min。进行25个循环后，最后一个循环72℃延长至10min。迅速冷却4℃。第四十二页，共七十页。实验结果121.PCR产物2.MarkerPCR产物的琼脂糖凝胶电泳第四十三页，共七十页。PCR片段的TA克隆第四十四页，共七十页。实验原理T载体的特点是将普通的克隆载体切成线状，并使之在3'末端含有一个凸出碱基T；Taq

DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片段的3'末端添加一个核苷酸，通常为A。因此，TaqDNA聚合酶扩增的产物可与T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。第四十五页，共七十页。试剂与器材1、材料：纯化的PCR产物2、试剂

（1）LB液体培养基（2）1.5%琼脂LB固体培养基（3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）储存液(20mg/mL)（4）异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）储液(20mg/mL)（7）pEASY-Blint载体系统3、仪器

全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、

超净工作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统第四十六页，共七十页。实验步骤PCR产物T载体连接缓冲液连接酶室温10min转化大肠杆菌37℃过夜铺平板TA质粒的构建

⑴连接反应一般在灭菌的0.5mL离心管中进行。

⑵10μL体积反应体系中：pEasy载体1μL纯化的PCR产物3μL⑶轻轻混匀，室温下放置反应10min。第四十七页，共七十页。转化（1）取一装有的100μL感受态细胞的EP管，加入上一步联结产物，冰浴上放置30min。（2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，热激45s，快速转移到冰浴中放置2min。（3）向每个EP管加入500μL的LB培养基，转移至37℃恒温摇床上，150r/min，温育45min以复苏菌株。

（4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL），以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。

（5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃过夜培养。第四十八页，共七十页。实验结果重组载体的蓝白筛选第四十九页，共七十页。连接第五十页，共七十页。CA

T

A

T

GG

T

A

T

ACTCT

A

G

AA

G

A

TCT实验原理第五十一页，共七十页。试剂与器材1、材料纯化的片段及载体2、试剂

（1）LB液体培养基（2）1.5%琼脂LB固体培养基（3）T4连接酶及缓冲液3、仪器

全自动高压灭菌锅、恒温水浴槽、高速冷冻离心机、

超净工作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统第五十二页，共七十页。实验步骤表达载体目的片段SolutionI16℃30min转化大肠杆菌37℃过夜铺平板表达载体的构建

⑴连接反应一般在灭菌的0.5mL离心管中进行。

⑵10μL体积反应体系中：目的片段3μL表达载体2μLSolutionI5μL⑶轻轻混匀，16℃30min。第五十三页，共七十页。重组子的鉴定质粒的提取阳性重组子的酶切鉴定阳性重组子的PCR鉴定第五十四页，共七十页。实验结果第五十五页，共七十页。诱导表达第五十六页，共七十页。实验步骤1、将工程菌接种LB液体培养基中，37℃振摇培养OD600=0.62、加入终浓度为1mmol/L的IPTG。3、继续培养5小时。第五十七页，共七十页。表达产物的SDS鉴定第五十八页，共七十页。实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质及小分子核酸进行量化、比较和特性鉴定的一种快速方法。在蛋白质样品中加入SDS后，所有的蛋白质分子都与SDS结合并带有负电荷，因此蛋白质在电场中的移动主要取决于蛋白质分子量的大小，而于蛋白质本身的等电点无关。为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系，该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液pH值，蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此当蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提高了分辨率。第五十九页，共七十页。试剂与器材试剂

1、丙烯酰胺溶液中含有甲叉双丙稀酰胺2、过硫酸铵（聚合的引发剂）3、四甲基乙二胺（加速剂，可加快聚合的速度）仪器

垂直板电泳槽和电泳仪第六十页，共七十页。实验步骤1、倒制胶板。将两玻璃板密封好，将所需浓度的分离胶溶液按比例加入烧杯混匀。倒入密封好的玻璃板间隙中，用少量正丁醇覆盖液面，以隔绝空气，并产生整齐的上液面。胶液的聚合大约需要半小时，随后倒掉胶板上沿的液体并加入配置好的浓缩胶溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。2、加样与电泳蛋白质样品在加样前需要和样品缓冲液混合并煮沸5min，使蛋白质发生溶解、变性。3、将制胶板中的密封胶条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，装好电泳槽，接好电源，开始电泳。4、染色与脱色电泳结束后，分离玻璃板，取出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考马氏亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中脱色。5、用凝胶成像系统进行分析。第六十一页，共七十页。实验结果

１、低分子量标准蛋白２,3、经IPTG诱导的工程菌４、未经IPTG诱导的工程菌1234第六十二页，共七十页。表达产物的分离纯化胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化发酵液细胞分离第六十三页，共七十页。在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为无活性的蛋白质。包含体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作实验原理第六十四页，共七十页。试剂与器材试剂洗涤缓冲液（50mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）洗涤液（20mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，2mol/LUrea，0.5%TritonX-100，pH8.0）溶解液（10mmol/LTris-HCl，8mol/LUrea，50mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/LMEDTA，pH8.0）稀释液（3mol/LUrea，10mmol/LTris-HCl，pH8.0）复性缓冲液（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0）器材低温高速离心机、超声波粉碎仪、光学显微镜材料透析袋、烧杯等第六十五页，共七十页。实验步骤包含体分离包含体溶解包含体复性菌体裂解包涵体洗涤先用洗涤缓冲液离心洗涤菌体3次后用洗涤缓冲液将菌体稀释成1g/10ml浓度混悬液，在冰浴下超声破碎菌体，然后4℃、10000g离心20分钟，收集包