蛋白质检测方法课件

蛋白质检测研究进展蛋白质检测研究进展1Contents、蛋白质简介2、蛋白质的检测方法3、蛋白质与疾病的关系Contents2蛋白质简介蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物,其主要化学元素为C(约50%)、O(约23%)、N(约16%)、H(约7%)、S(约0~3%)。氨基酸是蛋白质的基本组成单位,蛋白质既具有氨基酸的部分理化特性,也具有其它有机物的一些共性以及众多的自身独有特点与性质:高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应(双缩脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α氦基及α-羧基反应、)蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关蛋白质简介3蛋白质的检测方法√传统蛋白质检测方法:免疫印迹法;酶联免疫吸附试验常规方法:物理法:紫外吸收法化学法:凯氏定氮法;比色法√高效液相色谱法毛细管凝胶电泳法√近红外光谱法质谱法荧光法蛋白质的检测方法4免疫印迹法(Westernblot)√原理:蛋白样品经过电泳分离后,转移并固定于膜上,然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。Wester杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的检测方法√免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法,也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法免疫印迹法(Westernblot)5样品的凝胶电泳蛋白印迹封闭反应免疫印迹法检测样品中特异与特异性抗体(一抗)孵育蛋白质的基本流程与酶耦联的二抗孵育显色或化学发光显影观察和记录结果样品的凝胶电泳6酶联免疫吸附试验原理:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbantsay,ELISA)是一种固相免疫测定技术,先将已知的抗原或抗体包被到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度(OD)值的大小进行定性或定量分析。优点:灵敏度高;特异性好;简便;重复性好√LISA和Wester杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用,借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。酶联免疫吸附试验7紫外吸收法√理论基础:蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氦酸残基使其在280n处具有紫外吸收,其吸光度与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的吸光度值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后能回收缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多,若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰紫外吸收法8凯氏定氮法理论基础1.各种蛋白质的含氮量很接近,通常占其总重量的16%左右2.蛋白质样品用浓硫酸消化后,可以转变为硫酸铵,硫酸铵中的NH4+与NaOH反应叉可转变为NH3,用硼酸液吸收后,可由标准盐酸滴定并定量。凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氪物,因此,通过测定生物样品的含氮量便可估算岀样品中的总蛋白质含量。蛋白质含量=含氮量Ⅹ6.25此方法的测定范围为0.2~1.0mg氮。√优点:应用范围广,重现性好、准确度高缺点:局限于样品中总蛋臼的检测,破坏蛋白质结构,易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰凯氏定氮法9比色法-双缩脲法原理:蛋白质含有两个以上的肽键,故有双缩脲(NHCO-NH-CO-NH2)反应。在碱性条件下,肽键的质子被解离,Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物在540~560nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物的颜色差别极小,使得该方法比较适合总蛋白质的检测。√优点:操作简单、测量速度快√缺点:灵敏度较差,精度不高比色法-双缩脲法10蛋白质检测方法课件11蛋白质检测方法课件12蛋白质检测方法课件13蛋白质检测方法课件14蛋白质检测方法课件15蛋白质检测方法课件16蛋白质检测方法课件17蛋白质检测方法课件18蛋白质检测方法课件19蛋白质检测方法课件20蛋白质检测方法课件21蛋白质检测方法课件22蛋白质检测方法课件23蛋白质检测方法课件24蛋白质检测方法课件25蛋白质检测方法课件26蛋白质检测方法课件27蛋白质检测方法课件28蛋白质检测方法课件29蛋白质检测方法课件30蛋白质检测方法课件31蛋白质检测方法课件32蛋白质检测方法课件33蛋白质检测方法课件34蛋白质检测方法课件35蛋白质检测方法课件36蛋白质检测方法课件37蛋白质检测方法课件38蛋白质检测方法课件39蛋白质检测方法课件40蛋白质检测方法课件41蛋白质检测研究进展蛋白质检测研究进展42Contents、蛋白质简介2、蛋白质的检测方法3、蛋白质与疾病的关系Contents43蛋白质简介蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物,其主要化学元素为C(约50%)、O(约23%)、N(约16%)、H(约7%)、S(约0~3%)。氨基酸是蛋白质的基本组成单位,蛋白质既具有氨基酸的部分理化特性,也具有其它有机物的一些共性以及众多的自身独有特点与性质:高分子、两性解离及等电点、水合作用、变性作用、显色反应(双缩脲反应、Folin-酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反应、坂口反应、偶氮反应、考马斯亮蓝反应、氨基酸的α氦基及α-羧基反应、)蛋白质的异常表达与体内多种疾病的发生发展息息相关蛋白质简介44蛋白质的检测方法√传统蛋白质检测方法:免疫印迹法;酶联免疫吸附试验常规方法:物理法:紫外吸收法化学法:凯氏定氮法;比色法√高效液相色谱法毛细管凝胶电泳法√近红外光谱法质谱法荧光法蛋白质的检测方法45免疫印迹法(Westernblot)√原理:蛋白样品经过电泳分离后,转移并固定于膜上,然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。Wester杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定相结合的特异性蛋白质的检测方法√免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法,也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法免疫印迹法(Westernblot)46样品的凝胶电泳蛋白印迹封闭反应免疫印迹法检测样品中特异与特异性抗体(一抗)孵育蛋白质的基本流程与酶耦联的二抗孵育显色或化学发光显影观察和记录结果样品的凝胶电泳47酶联免疫吸附试验原理:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbantsay,ELISA)是一种固相免疫测定技术,先将已知的抗原或抗体包被到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗原或抗体发生特异性反应。最后加入酶反应底物根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度(OD)值的大小进行定性或定量分析。优点:灵敏度高;特异性好;简便;重复性好√LISA和Wester杂交都利用抗原抗体间的分子识别作用,借助不同的抗体分子标记实现蛋白质的检测。酶联免疫吸附试验48紫外吸收法√理论基础:蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氦酸残基使其在280n处具有紫外吸收,其吸光度与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的吸光度值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后能回收缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多,若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰紫外吸收法49凯氏定氮法理论基础1.各种蛋白质的含氮量很接近,通常占其总重量的16%左右2.蛋白质样品用浓硫酸消化后,可以转变为硫酸铵,硫酸铵中的NH4+与NaOH反应叉可转变为NH3,用硼酸液吸收后,可由标准盐酸滴定并定量。凯氏定氮法由于蛋白质是体内的主要含氪物,因此,通过测定生物样品的含氮量便可估算岀样品中的总蛋白质含量。蛋白质含量=含氮量Ⅹ6.25此方法的测定范围为0.2~1.0mg氮。√优点:应用范围广,重现性好、准确度高缺点:局限于样品中总蛋臼的检测,破坏蛋白质结构,易受到被测样品中其它有机含氮化合物的干扰凯氏定氮法50比色法-双缩脲法原理:蛋白质含有两个以上的肽键,故有双缩脲(NHCO-NH-CO-NH2)反应。在碱性条件下,肽键的质子被解离,Cu2+和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的紫色络合物在540~560nm的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。由于与双缩脲试剂与不同种类的蛋白质反应产物的颜色差别极小,使得该方法比较适合总蛋白质的检测。√优点:操作简单、测量速度快√缺点:灵敏度较差,精度不高比色法-双缩脲法51蛋白质检测方法课件52蛋白质检测方法课件53蛋白质检测方法课件54蛋白质检测方法课件55蛋白质检测方法课件56蛋白质检测方法课件57蛋白质检测方法课件58蛋白质检测方法课件59蛋白质检测方法课件60蛋白质检测方法课件61蛋白质检测方法课件62蛋白质检测方法课件63蛋白质检测方法课件64蛋白质检测方法课件65蛋白质