动物基因组学基础课件

第八章

动物基因组学基础第一节

动物遗传标记一

遗传标记的概念及其发展

（一）遗传标记的概念

遗传标记是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型、并能稳定遗传的物质标志。遗传标记是一些等位基因或遗传物质，能在生物体上以各种形式表现出各种变异。遗传标记的概念经历了从宏观到微观、从外部到内部、从蛋白质到DNA的发展过程。1第八章

动物基因组学基础第一节

动物遗传标记1

（二）遗传标记概念的发展

□形态学标记

能用肉眼观察和识别的外部性状。例如，动物的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。此法简单直观，但标记数目少、多态性低、易受环境影响。

□细胞遗传标记

主要是指染色体核型（染色体的数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数量的变异。此法能反映出染色体结构和数目的多态性，但由于这些变异往往带来有害的表型效应，生物难以忍受。2

（二）遗传标记概念的发展2

□免疫遗传标记

以动物的免疫学特征为标记，主要是红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。·红细胞抗原多态性——血型，以细胞表面的抗原而定·白细胞抗原多态性——主要组织兼容性复合体（MHC），以白细胞表面的抗原而定。□生化遗传标记（蛋白质多态性标记）

同一种动物中，具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体，有些可以用电泳方法区分其中的差异。3

□免疫遗传标记3

□

分子遗传标记

○分子遗传标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，又称DNA分子标记或多态性DNA标记。

○自20世纪70年代以来，随着分子生物学的发展，相继建立了多种分子遗传标记检测技术，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。

○分子遗传标记的特点：遗传多态性高；检测方法简单快捷；遗传共显性，能分离出等位基因的三种基因型。4

□

分子遗传标记4

二、分子遗传标记

（一）限制性片段长度多态性（restictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）○RFLPRFLP是1980年建立的第一代分子遗传标记。原理：用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，如果存在酶切位点的变化，就会产生长度不同的DNA片段，电泳后用克隆探针检测时，就会出现泳动行为的改变。

基本过程：取得DNA样本——酶切——电泳——转移至硝酸纤维膜上——DNA探针杂交——放射自显影5

二、分子遗传标记5图7-1Southern杂交过程6图7-1Southern杂交过程6图7-2RFLP检测7图7-2RFLP检测7

○聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是1985年建立的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

原理：在反应温度为90—95℃时，DNA变性成为单链；反应温度降至45—65℃时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72℃左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“变性——退火——延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。8○聚合酶链式反应（polymerasecha图7-3DNA

扩增原理9图7-3DNA

扩增原理9

○PCR—RFLP

如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可用PCR快速而简单地进行RFLP分析。首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物；以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多态性。

10

○PCR—RFLP10图7-4PCR—RFLP11图7-4PCR—RFLP11

（二）串联重复序列标记（tandemrepeatedsequence,TRS）

○真核基因组序列

单一序列

短片段重复序列（正向重复、反向重复、回文序列）

长片段重复序列（轻度重复、中度重复、高度重复）

12

（二）串联重复序列标记（tandemrepeateds

高度重复序列

卫星DNA（satelliteDNA）序列中G-C含量约30%，远低于基因组中主体DNA（G-C含量约42%）。将DNA切成片段进行氯化铯密度梯度离心时，由于富含A-T浮力密度小，形成一条窄带在主体DNA外面，故称卫星DNA。

小卫星DNA（minisatelliteDNA）

微卫星DNA（microsatelliteDNA）13

高度重复序列13图7-6卫星DNA14图7-6卫星DNA14

○小卫星标记

小卫星DNA是一种可变数量的串联重复（variblenumberoftandemrepeats,VNTR），在不同个体和基因组的不同位点上数目都不同。

用内切酶把总DNA切成不同长度的片段（VNTR上没有酶切位点），再以VNTR中的特殊序列为探针进行Southern杂交，由于不同个体的这种串联重复的数目及位置不同，所以VNTR的Southern杂交谱带具有高度的个体特异性，故又称其为DNA指纹（DNAfingerprints）。15○小卫星标记15

○微卫星标记

微卫星DNA又称短串联重复序列（STR），重复单位的核心序列为2—6bp。

以微卫星DNA两侧特异性序列设计探针，用PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经电泳分离，不同个体因核心序列重复次数不同而产生DNA多态性。16

○微卫星标记16真核生物基因组序列17真核生物基因组序列17一个家系的微卫星PCR检测结果18一个家系的微卫星PCR检测结果18

（三）单核苷酸多态性标记（singlenucleotidepolymorphism,SNP）

SNP与RFLP、STR等标记不同之处在于不以“长度”差别为检测手段，而是直接以序列的变异作为标记。

基因组DNA某一特定的核苷酸位置上，可能发生单个碱基的变化，如转换、颠换等，使得群体中基因组的某些位点上存在差异。

SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%则视为突变）。

19

（三）单核苷酸多态性标记（singlenucle

SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每1000bp中就有1个SNP，总数可达300万个。位于基因表达序列内的SNP可能会影响蛋白质的结构和表达水平，对分析基因与性状的关系有重要意义。SNP是单碱基突变，任何用于单碱基突变的技术都可用于SNP检测，如RFLP、DNA序列分析、单链构象多态性（SSCP）等。最先进的是微数列矩阵DNA芯片（DNAchip）技术。

20SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每10

三、分子遗传标记的应用

○个体及亲缘关系的鉴定DNA指纹○遗传资源的评估、监测、保护和利用○基因定位和遗传图谱的构建○标记辅助选择21

三、分子遗传标记的应用21

第二节

基因组作图一、基本概念

○基因组作图主要分两个范畴：遗传作图（geneticsmapping）和物理作图（physicalmapping）。

○作图需要界标（landmark）或遗传标记（geneticsmarker）。常用的遗传标记（血型、蛋白质多态型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期构建遗传图时常用作制图的界标。现在主要采用以下的界标：限制性片段长度多态性（RFLP）微卫星DNA多态性界标单核苷酸多态性（SNP）界标非多态的短单一序列作为界标22

第二节

基因组作图22

二、遗传图

（一）基本概念

应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上位置的图。

方法是以多态的遗传标记作为界标，计算细胞减数分裂过程中遗传标记之间发生重组的频率，来确定两个遗传标记在染色体上的相对位置。

遗传标记之间的相对距离即图距以厘摩（cM，厘摩尔根，centi-Morgan）为单位。当两个遗传标记之间的重组值为1%时，图距即为1cM。23

二、遗传图23

经典遗传图的作图最常用的是三点测交法。

现代遗传图的概念是于1980年提出的，就是将单纯的表型多态性界标改变为以DNA序列的多态作为作图界标。

各种遗传界标可在国际互联网上可以查阅（）。

当用DNA序列多态作为界标的遗传图时，一但确定该DNA界标与某一基因的具体位置，便可分离克隆这个基因。

人类第一张以RFLP为界标的遗传图发表于1987年。24经典遗传图的作图最常用的是三点测交法。24

（二）遗传图的局限性

分辨率有限

高等真核生物子代数量有限，只有少数的减数分裂事件可供研究，连锁分析的分辨率受很大限制

人类基因组测序要求每100kb有一个标记，1996年发表的人类遗传图达到每0.6Mb一个标记（1Mb=1000kb）

精确度较低

假设交换是随机发生的，但由于交换热点的存在使某一区段的交换频率远高于其它区段，无法绘制精确的遗传图。

25

25

三、物理图（一）基本概念

应用分子生物学技术来直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的序列特征的位置图。

以特定的DNA序列为界标直接排列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的（如RFLP），但主要是非多态的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。

物理图中界标之间的距离单位依作图方法而定，辐射育种作图单位为厘镭（cR），限制性作图单位元以物理长度，即碱基对数目（bp、kb）来表示。26

三、物理图26

（二）作图的基本方法

1．限制性作图——将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置上。

限制性内切酶有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅲ型酶位点特殊性不强，Ⅱ型专一性很强。

6bp识别序列的限制性内切酶适用于50kb以下的DNA分子作图。

限制性作图方法是：比较一个DNA分子被两种酶切割产生的两套片段。27

（二）作图的基本方法27图7-16限制性内切酶28图7-16限制性内切酶28

3．序列标记位点（sequencetaggedsite,STS）作图——通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。是目前用于构建最为详尽的大基因组物理图的主流技术。○STS作图原理

STS是一段短的DNA序列（100—500）bp，每个基因组只有一个拷贝。

当两个片段含有同一STS时，可确认这两个片段重叠。

两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在同一片段的机会就大，反之则小。

两个标记间的图距根据分离频率来计算。29

3．序列标记位点（sequencetagged○STS的种类

⑴表达序列标记（expressedsequencetag,EST），是从cDNA克隆中获得的短序列。EST是获得基因序列的简捷方法。

⑵简单序列长度多态性（SSLP，小卫星和微卫星）。

⑶随机基因组序列，从克隆的基因组DNA中随机测序获得。30○STS的种类30

第三节

基因定位方法

动物有几十条染色体，有几万个基因，平均每条染色体有上千个基因。

确定基因在哪一条染色体的哪一个座位上就是基因定位。 将定位的基因标注在染色体上就可得到基因图（genemap）

基因定位与基因组作图和基因克隆关系密切：基因定位后可以作为一个界标；确定基因的位置后就可按图去分离克隆基因不同生物的基因定位方法不完全相同。基因定位的方法随着遗传学的发展而进步。31

第三节

基因定位方法31一、质量性状的基因定位

质量性状——从表型上可以明显区分为不同类型的性状。（一）家系分析定位法

性连锁分析是最常用的方法。哺乳动物中只出现在雄性的性状，控制该性状的基因在Y染色体上。性状出现隔代交叉遗传、且雄性出现比例高于雌性，则控制该性状的基因在Y染色体上。（二）遗传重组值定位法

摩尔根提出的方法，根据基因间的重组值与遗传距离成正比的原理，采用两点测交和三点测交的方法进行基因定位。32一、质量性状的基因定位32

（三）体细胞杂交定位法

不同物种细胞融合后，杂种细胞会出现排除某一亲本染色体的现象，在人鼠杂种细胞常专一性地排除人的染色体。可以制备含一条（或少数几条）人染色体的杂种细胞。○定位测验法

鉴别杂种细胞中保留了哪些人染色体，测定杂种细胞产生了哪些基因产物，经分析可将基因定位在哪一条染色体上。33

（三）体细胞杂交定位法33（四）原位杂交定位

将待定位基因的特定DNA序列或该基因转录的RNA作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后，与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定探针（即待定基因）在染色体上的位置。34（四）原位杂交定位34二、数量性状的基因定位

○数量性状——由微效多基因控制的呈连续变异的性状。由于每个基因效应值都较小，无法阐明单个基因的行为和效应，只能当作一个整体来分析。同时，对控制数量性状的基因数目不能准确估计，不能用提供基因的实际位置和功能上的信息。

随着分子数量遗传学的发展，极大地深化了数量遗传学的理伦，提供了在DNA水平研究数量性状的先进技术。35二、数量性状的基因定位35

○主效基因——对某一数量性状具有很大的效应的等位基因。由于自发或诱发突变引起明显的形态学上的变异。如猪的氟烷基因、牛的双肌基因等。○数量性状基因位点（QTL）

具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区域内，从而形成基因群。控制同一性状的微效基因可能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色体的一定区域，称作数量性状基因座（quantitativetraitlocus,QTL）

36

○主效基因——对某一数量性状具有很大的效应的等位基

一些QTL可以对数量性状有较大的影响（对数量性状的影响超过表型值方差的5%），因而具有选择价值一个数量性状往往受多个QTL的影响，这些QTL分布在基因组的不同位置上。利用特定的遗传标记可以确定影响某一性状的QTL在染色体上的数目、位置及其遗传效应，这就是QTL作图或称QTL定位QTL作图原理：利用特定遗传分离群体中的遗传标记及相应的数量性状观察值，分析遗传标记与性状之间的连锁关系。如果证明遗传标记与性状连锁，则可认定标记附近存在一个或几个QTL37

一些QTL可以对数量性状有较大的影响（对数量性状的影

QTL作图步骤：

⑴构建作图群体——该群体待测的数量性状存在广泛变异，如F2群体⑵选用合适的遗传标记——须具备4个特征：数量丰富，多态性好，中性，共显性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等⑶测定标记的基因型，制作标记的遗传图谱——应含有P1，P2和杂合型三种带型（即三种基因型）。⑷测量数量性状——测定遗传标记时，测定其数量性状值⑸统计分析——单标记分析、双分子标记分析、多分子标记分析。38

QTL作图步骤：38定位QTL主要有两种方法：

基因组扫描——利用遗传上差异较大的品种进行杂交，跟踪性状和染色体上的标记在多世代家系中的分离情况。

候选基因法——不需特定品种的杂交，只要发现一个候选基因位点上存在多态性，便可直接在商业品系中研究该多态性与目标性状之间的相关性。39定位QTL主要有两种方法：39

QTL的性质

⑴QTL可能是一个基因，也可能是几个基因；⑵数量性状受为数不多、效应不等的几个QTL影响。少数位点对性状变异贡献很大⑶由于不同群体的遗传背景不同，根据不同群体确定的QTL会有差异⑷统计分析确定的QTL的位置并非物理上的位置40

QTL的性质40

QTL的应用

⑴由QTL得到的遗传图可进一步换算成物理图，对QTL进行克隆和序列分析，研究控制数量性状的基因结构和功能。⑵在育种上进行标记辅助选择，利用标记与性状的连锁提早进行识别和选择。⑶利用标记与性状的连锁分析，可以提供与杂种优势有关的信息，鉴定与优势有关的位点，确定亲本在QTL上的差异，可能预测杂种优势。41

QTL的应用41

第四节

动物基因组学一、基因组研究的新学科

基因组学（genomics）——研究基因组结构与功能的分支学科，又分为结构基因组学和功能基因组学。

转录物组学（transcriptomics）——研究某一时刻某一细胞里基因组产生的全部转录物的种类、结构和功能。

蛋白质组学（proteomics）——研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的学科。

表型组学（phenomics）——研究生物体整个表型形成的机制。42

第四节

动物基因组学42二、人类基因组计划

○美国于1990年由能源部和国立卫生研究院起动了预算耗时15年、经费30亿美元的人类基因组计划○2001年2月15日，由中、美、英、法、德、日等6国科学家组成的“人类基因组测序国际协作组”，在《自然》杂志上发表了关于人类基因组框架图的数据；次日，美国CeleraGenomics公司的也公布了人类基因组框架图的数据。有关人类遗传本性的“生命之书”的诞生，是生命科学发展史上的一个重要里程碑。43二、人类基因组计划43

○人类基因组计划的主要内容

⑴基因组作图——绘制遗传图，物理图。

⑵测序——测定全基因组DNA分子的核苷酸序列，绘制序列图。

⑶基因识别——识别出基因序列，设法克隆基因，研究基因功能。

⑷模式生物研究——大肠杆菌、酵母菌、线虫、果蝇、小鼠等。

⑸发展生物信息学和计算生物学

⑹基因组对伦理、法律和社会产生的影响

44○人类基因组计划的主要内容44

三、动物基因组计划及其应用前景

先后开展猪、牛、绵羊、鸡等动物的基因组研究，目标大致相同。○猪基因组计划的目标

构建遗传图——复盖基因组90%以上，标记间距20cM左右的遗传图；

构建标记位点——每条染色体臂至少一个远端和近端的标记；

·开发猪染色体激光流动分型技术；·开发快速测定多态分子的PCR技术；·开发和评估用于分析QTL作图试验数据的统计方法……

45

三、动物基因组计划及其应用前景45

○应用前景

·

基因诊断——检测基因型，区分显性纯合体和带缺陷隐性基因的杂合体，从而淘汰隐性基因。

·

标记辅助选择和标记辅助导入基因——

标记辅助选择是利用与影响性状紧密连锁的遗传标记来进行选择。

标记辅助导入基因是指检测杂种后代的基因型，选留带有所需基因的杂种个体作种用，再与亲本回交……，多次重复可将基因导入。·研究地方品种种质特性46

○应用前景46第八章

动物基因组学基础第一节

动物遗传标记一

遗传标记的概念及其发展

（一）遗传标记的概念

遗传标记是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型、并能稳定遗传的物质标志。遗传标记是一些等位基因或遗传物质，能在生物体上以各种形式表现出各种变异。遗传标记的概念经历了从宏观到微观、从外部到内部、从蛋白质到DNA的发展过程。47第八章

动物基因组学基础第一节

动物遗传标记1

（二）遗传标记概念的发展

□形态学标记

能用肉眼观察和识别的外部性状。例如，动物的毛色、角形、耳型、体型、外貌等。此法简单直观，但标记数目少、多态性低、易受环境影响。

□细胞遗传标记

主要是指染色体核型（染色体的数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数量的变异。此法能反映出染色体结构和数目的多态性，但由于这些变异往往带来有害的表型效应，生物难以忍受。48

（二）遗传标记概念的发展2

□免疫遗传标记

以动物的免疫学特征为标记，主要是红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。·红细胞抗原多态性——血型，以细胞表面的抗原而定·白细胞抗原多态性——主要组织兼容性复合体（MHC），以白细胞表面的抗原而定。□生化遗传标记（蛋白质多态性标记）

同一种动物中，具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体，有些可以用电泳方法区分其中的差异。49

□免疫遗传标记3

□

分子遗传标记

○分子遗传标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，又称DNA分子标记或多态性DNA标记。

○自20世纪70年代以来，随着分子生物学的发展，相继建立了多种分子遗传标记检测技术，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。

○分子遗传标记的特点：遗传多态性高；检测方法简单快捷；遗传共显性，能分离出等位基因的三种基因型。50

□

分子遗传标记4

二、分子遗传标记

（一）限制性片段长度多态性（restictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）○RFLPRFLP是1980年建立的第一代分子遗传标记。原理：用限制性内切酶切割不同个体的DNA时，如果存在酶切位点的变化，就会产生长度不同的DNA片段，电泳后用克隆探针检测时，就会出现泳动行为的改变。

基本过程：取得DNA样本——酶切——电泳——转移至硝酸纤维膜上——DNA探针杂交——放射自显影51

二、分子遗传标记5图7-1Southern杂交过程52图7-1Southern杂交过程6图7-2RFLP检测53图7-2RFLP检测7

○聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）

PCR是1985年建立的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

原理：在反应温度为90—95℃时，DNA变性成为单链；反应温度降至45—65℃时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72℃左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“变性——退火——延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。54○聚合酶链式反应（polymerasecha图7-3DNA

扩增原理55图7-3DNA

扩增原理9

○PCR—RFLP

如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可用PCR快速而简单地进行RFLP分析。首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物；以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多态性。

56

○PCR—RFLP10图7-4PCR—RFLP57图7-4PCR—RFLP11

（二）串联重复序列标记（tandemrepeatedsequence,TRS）

○真核基因组序列

单一序列

短片段重复序列（正向重复、反向重复、回文序列）

长片段重复序列（轻度重复、中度重复、高度重复）

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（二）串联重复序列标记（tandemrepeateds

高度重复序列

卫星DNA（satelliteDNA）序列中G-C含量约30%，远低于基因组中主体DNA（G-C含量约42%）。将DNA切成片段进行氯化铯密度梯度离心时，由于富含A-T浮力密度小，形成一条窄带在主体DNA外面，故称卫星DNA。

小卫星DNA（minisatelliteDNA）

微卫星DNA（microsatelliteDNA）59

高度重复序列13图7-6卫星DNA60图7-6卫星DNA14

○小卫星标记

小卫星DNA是一种可变数量的串联重复（variblenumberoftandemrepeats,VNTR），在不同个体和基因组的不同位点上数目都不同。

用内切酶把总DNA切成不同长度的片段（VNTR上没有酶切位点），再以VNTR中的特殊序列为探针进行Southern杂交，由于不同个体的这种串联重复的数目及位置不同，所以VNTR的Southern杂交谱带具有高度的个体特异性，故又称其为DNA指纹（DNAfingerprints）。61○小卫星标记15

○微卫星标记

微卫星DNA又称短串联重复序列（STR），重复单位的核心序列为2—6bp。

以微卫星DNA两侧特异性序列设计探针，用PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经电泳分离，不同个体因核心序列重复次数不同而产生DNA多态性。62

○微卫星标记16真核生物基因组序列63真核生物基因组序列17一个家系的微卫星PCR检测结果64一个家系的微卫星PCR检测结果18

（三）单核苷酸多态性标记（singlenucleotidepolymorphism,SNP）

SNP与RFLP、STR等标记不同之处在于不以“长度”差别为检测手段，而是直接以序列的变异作为标记。

基因组DNA某一特定的核苷酸位置上，可能发生单个碱基的变化，如转换、颠换等，使得群体中基因组的某些位点上存在差异。

SNP就是指基因组内特定的核苷酸位置上存在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1%（低于1%则视为突变）。

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（三）单核苷酸多态性标记（singlenucle

SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每1000bp中就有1个SNP，总数可达300万个。位于基因表达序列内的SNP可能会影响蛋白质的结构和表达水平，对分析基因与性状的关系有重要意义。SNP是单碱基突变，任何用于单碱基突变的技术都可用于SNP检测，如RFLP、DNA序列分析、单链构象多态性（SSCP）等。最先进的是微数列矩阵DNA芯片（DNAchip）技术。

66SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平均每10

三、分子遗传标记的应用

○个体及亲缘关系的鉴定DNA指纹○遗传资源的评估、监测、保护和利用○基因定位和遗传图谱的构建○标记辅助选择67

三、分子遗传标记的应用21

第二节

基因组作图一、基本概念

○基因组作图主要分两个范畴：遗传作图（geneticsmapping）和物理作图（physicalmapping）。

○作图需要界标（landmark）或遗传标记（geneticsmarker）。常用的遗传标记（血型、蛋白质多态型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期构建遗传图时常用作制图的界标。现在主要采用以下的界标：限制性片段长度多态性（RFLP）微卫星DNA多态性界标单核苷酸多态性（SNP）界标非多态的短单一序列作为界标68

第二节

基因组作图22

二、遗传图

（一）基本概念

应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上位置的图。

方法是以多态的遗传标记作为界标，计算细胞减数分裂过程中遗传标记之间发生重组的频率，来确定两个遗传标记在染色体上的相对位置。

遗传标记之间的相对距离即图距以厘摩（cM，厘摩尔根，centi-Morgan）为单位。当两个遗传标记之间的重组值为1%时，图距即为1cM。69

二、遗传图23

经典遗传图的作图最常用的是三点测交法。

现代遗传图的概念是于1980年提出的，就是将单纯的表型多态性界标改变为以DNA序列的多态作为作图界标。

各种遗传界标可在国际互联网上可以查阅（）。

当用DNA序列多态作为界标的遗传图时，一但确定该DNA界标与某一基因的具体位置，便可分离克隆这个基因。

人类第一张以RFLP为界标的遗传图发表于1987年。70经典遗传图的作图最常用的是三点测交法。24

（二）遗传图的局限性

分辨率有限

高等真核生物子代数量有限，只有少数的减数分裂事件可供研究，连锁分析的分辨率受很大限制

人类基因组测序要求每100kb有一个标记，1996年发表的人类遗传图达到每0.6Mb一个标记（1Mb=1000kb）

精确度较低

假设交换是随机发生的，但由于交换热点的存在使某一区段的交换频率远高于其它区段，无法绘制精确的遗传图。

71

25

三、物理图（一）基本概念

应用分子生物学技术来直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的序列特征的位置图。

以特定的DNA序列为界标直接排列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的（如RFLP），但主要是非多态的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。

物理图中界标之间的距离单位依作图方法而定，辐射育种作图单位为厘镭（cR），限制性作图单位元以物理长度，即碱基对数目（bp、kb）来表示。72

三、物理图26

（二）作图的基本方法

1．限制性作图——将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置上。

限制性内切酶有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅲ型酶位点特殊性不强，Ⅱ型专一性很强。

6bp识别序列的限制性内切酶适用于50kb以下的DNA分子作图。

限制性作图方法是：比较一个DNA分子被两种酶切割产生的两套片段。73

（二）作图的基本方法27图7-16限制性内切酶74图7-16限制性内切酶28

3．序列标记位点（sequencetaggedsite,STS）作图——通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。是目前用于构建最为详尽的大基因组物理图的主流技术。○STS作图原理

STS是一段短的DNA序列（100—500）bp，每个基因组只有一个拷贝。

当两个片段含有同一STS时，可确认这两个片段重叠。

两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在同一片段的机会就大，反之则小。

两个标记间的图距根据分离频率来计算。75

3．序列标记位点（sequencetagged○STS的种类

⑴表达序列标记（expressedsequencetag,EST），是从cDNA克隆中获得的短序列。EST是获得基因序列的简捷方法。

⑵简单序列长度多态性（SSLP，小卫星和微卫星）。

⑶随机基因组序列，从克隆的基因组DNA中随机测序获得。76○STS的种类30

第三节

基因定位方法

动物有几十条染色体，有几万个基因，平均每条染色体有上千个基因。

确定基因在哪一条染色体的哪一个座位上就是基因定位。 将定位的基因标注在染色体上就可得到基因图（genemap）

基因定位与基因组作图和基因克隆关系密切：基因定位后可以作为一个界标；确定基因的位置后就可按图去分离克隆基因不同生物的基因定位方法不完全相同。基因定位的方法随着遗传学的发展而进步。77

第三节

基因定位方法31一、质量性状的基因定位

质量性状——从表型上可以明显区分为不同类型的性状。（一）家系分析定位法

性连锁分析是最常用的方法。哺乳动物中只出现在雄性的性状，控制该性状的基因在Y染色体上。性状出现隔代交叉遗传、且雄性出现比例高于雌性，则控制该性状的基因在Y染色体上。（二）遗传重组值定位法

摩尔根提出的方法，根据基因间的重组值与遗传距离成正比的原理，采用两点测交和三点测交的方法进行基因定位。78一、质量性状的基因定位32

（三）体细胞杂交定位法

不同物种细胞融合后，杂种细胞会出现排除某一亲本染色体的现象，在人鼠杂种细胞常专一性地排除人的染色体。可以制备含一条（或少数几条）人染色体的杂种细胞。○定位测验法

鉴别杂种细胞中保留了哪些人染色体，测定杂种细胞产生了哪些基因产物，经分析可将基因定位在哪一条染色体上。79

（三）体细胞杂交定位法33（四）原位杂交定位

将待定位基因的特定DNA序列或该基因转录的RNA作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后，与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可确定探针（即待定基因）在染色体上的位置。80（四）原位杂交定位34二、数量性状的基因定位

○数量性状——由微效多基因控制的呈连续变异的性状。由于每个基因效应值都较小，无法阐明单个基因的行为和效应，只能当作一个整体来分析。同时，对控制数量性状的基因数目不能准确估计，不能用提供基因的实际位置和功能上的信息。

随着分子数量遗传学的发展，极大地深化了数量遗传学的理伦，提供了在DNA水平研究数量性状的先进技术。81二、数量性状的基因定位35

○主效基因——对某一数量性状具有很大的效应的等位基因。由于自发或诱发突变引起明显的形态学上的变异。如猪的氟烷基因、牛的双肌基因等。○数量性状基因位点（QTL）

具有相同或相关功能的基因往往分布在某一染色体区域内，从而形成基因群。控制同一性状的微效基因可能存在于有限的几个基因群内，而一基因群占据染色体的一定区域，称作数量性状基因座（quantitativetraitlocus,QTL）

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○主效基因——对某一数量性状具有很大的效应的等位基

一些QTL可以对数量性状有较大的影响（对数量性状的影响超过表型值方差的5%），因而具有选择价值一个数量性状往往受多个QTL的影响，这些QTL分布在基因组的不同位置上。利用特定的遗传标记可以确定影响某一性状的QTL在染色体上的数目、位置及其遗传效应，这就是QTL作图或称QTL定位QTL作图原理：利用特定遗传分离群体中的遗传标记及相应的数量性状观察值，分析遗传标记与性状之间的连锁关系。如果证明遗传标记与性状连锁，则可认定标记附近存在一个或几个QTL83

一些QTL可以对数量性状有较大的影响（对数量性状的影

QTL作图步骤：

⑴构建作图群体——该群体待测的数量性状存在广泛变异，如F2群体⑵选用合适的遗传标记——须具备4个特征：数量丰富，多态性好，中性，共显性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等⑶测定标记的基因型，制作标记的遗传图谱——应含有P1，P2和杂合型三种带型（即三种基因型）。⑷测量数量性状——测定遗传标记时，测定其数量性状值⑸统计分析——单标记分析、双分子标记分析、多分子标记分析。84