免疫学新技术及其临床应用讲稿课件

免疫学检测新技术

及其临床应用

免疫学检测新技术

及其临床应用主要内容免疫学理论及技术研究和临床免疫学检测技术构成重要免疫学检测技术和新技术及其应用介绍主要内容免疫学理论及技术研究和临床一、免疫学理论及技术

研究和临床

一、免疫学理论及技术

研究和临床

1796年，爱得华•琴纳发明了牛痘疫苗从而保护人不得天花，WHO于1979年宣布天花灭绝。1796年，爱得华•琴纳发明了牛痘疫苗从而保护人不得天花，W免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件72011年诺贝尔生理学或医学奖BruceA.BeutlerBorninUSAJulesA.HoffmannBorninLuxembourgRalphM.SteinmanBorninCanada证实Toll基因编码产物在识别病原微生物激活免疫反应中发挥了关键性作用发现LPS受体：一种Toll样受体发现树突细胞可激活T细胞引发免疫应答72011年诺贝尔生理学或医学奖BruceA.Beutl传染病预防疾病治疗免疫诊断免疫学理论及技术研究的临床意义传染病预防免疫学理论及技术研究的临床意义接种疫苗预防脊髓灰质炎©WHO

接种疫苗预防脊髓灰质炎©WHO免疫学新技术及其临床应用讲稿课件已批准上市的细胞因子多肽药物IFNα肝炎、白血病、AIDS、癌症IFNγ类风关，感染性疾病，慢性肉芽肿，过敏性皮炎G-CSF化疗导致的粒细胞减少症、再障、自身骨髓移植GM-CSF化疗导致的血细胞减少症、再障、自身骨髓移植EPO慢性肾衰所致贫血、癌症或癌症化疗所致贫血、失血后贫血IL-2癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂IFN-β多发性硬化症IL-11放化疗所致的血小板减少症SCF与G-CSF联合应用于外周血干细胞移植EGF烧伤、溃疡(外用药，在中国应用)βFGF烧伤、外周神经炎(外用药，在中国应用)已批准上市的细胞因子多肽药物IFNα肝炎、白血病、AIDS、可溶性IL-1R(吸入剂）哮喘可溶性IL-1R(注射剂）急性髓样白血病、类风湿关节炎可溶性IL-4R哮喘抗IL-4人源化抗体哮喘可溶性TNF-RII-Fc融合蛋白类风湿关节炎、慢性心衰可溶性TNF-RI-Fc融合蛋白休克、类风湿关节炎、多发性硬化症人源化抗EGF-R2单抗乳腺癌抗TNF-α单抗局限性肠炎人源化抗IL-8抗体银屑病细胞因子或其受体拮抗剂及其临床应用可溶性IL-1R(吸入剂）哮喘可溶性IL-1R(注射剂）急性二、免疫学技术构成二、免疫学技术构成基于抗原抗体反应的检测技术细胞免疫检测技术基于抗原抗体反应的检测技术抗原抗体反应的特点特异性一种抗原只能与其刺激机体产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性称特异性。可逆性抗原抗体主要通过分子表面的氢键、疏水键、静电和范得华力非共价结合。可见性在一定范围内，抗原抗体比例合适时，可出现肉眼可见的反应物。阶段性抗原抗体特异性结合阶段；反应可见阶段。抗原抗体反应的特点特异性第一抗体（一抗）：用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体叫做一抗。第二抗体（二抗）：Ig具有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称二抗。第一抗体（一抗）：用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗原抗体反应类型和检测方法凝集反应沉淀反应补体参加的反应免疫标记技术抗原抗体反应类型和检测方法凝集反应抗原抗体反应

凝集反应（颗粒性抗原）

沉淀反应（可溶性抗原）

补体参加的反应：溶血空斑实验

免疫标记技术直接凝集反应玻片凝集：ABO血型鉴定试管凝集：肥达反应间接凝集反应：直接/间接Coombs试验间接凝集抑制反应：免疫妊娠诊断试验单向免疫扩散：定量双向免疫扩散：检测复杂抗原抗体、半定量免疫电泳：血清蛋白及抗体成分分析免疫酶技术（酶标记）ELISA免疫组化：以组织或细胞为抗原间接法:已知抗原测抗体夹心法:已知抗体测抗原免疫荧光技术:荧光素标记同位素标记技术:同位素标记抗原抗体反应凝集反应沉淀反应补体参加的反应免疫细胞的分离外周血（人）淋巴细胞分层液单个核细胞玻璃粘附法单核细胞淋巴细胞尼龙毛、E花结淘选、磁珠、流式T细胞B细胞淘选、磁珠、流式T细胞亚群（利用T细胞表面CD分子）免疫细胞的分离外周血（人）淋巴细胞分层液单个核细胞玻璃粘附法免疫细胞功能测定淋巴细胞功能测定吞噬细胞功能测定T细胞增殖试验B细胞增殖试验：细胞毒试验3H-TdR掺入法MTT掺入法溶血空斑试验51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法凋亡细胞检测法形态学DNA-ladderTUNEL流式中性粒细胞趋化功能的测定中性粒细胞吞噬功能的测定巨噬细胞吞噬功能测定炭粒廓清试验鸡红细胞吞噬试验免疫细胞功能测定T细胞增殖试验B细胞增殖试验：细胞毒试验3H四、重要免疫学检测技术和新技术及其应用介绍四、重要免疫学检测技术和新技术及其应用介绍抗体作为工具的治疗和检测方法细胞的分离和功能分子功能检测

免疫学新技术及其临床应用讲稿课件（一）抗体作为工具的治疗和检测方法

抗体技术

ELISAWestern-blot

免疫沉淀免疫组织化学（一）抗体作为工具的治疗和检测方法抗体技术1.抗体技术抗体技术的发展经历了三个阶段第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体（单克隆抗体）第三代：基因工程抗体

1.抗体技术抗体技术的发展经历了三个阶段（1）单克隆抗体技术原理

(1)B细胞能产生抗体，但不易在体外培养；

(2)骨髓瘤细胞能在体内、外无限增殖，但不能分泌抗体；

(3)两者形成的杂交瘤细胞即能大量增殖，又能合成和分泌特异性抗体。（1）单克隆抗体技术原理单克隆抗体的制备

制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。

B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。单克隆抗体的制备免疫学新技术及其临床应用讲稿课件单克隆抗体与常规抗血清的性质比较

单克隆抗体与常规抗血清的性质比较（2）基因工程抗体类型嵌合抗体人源化抗体完全人源化抗体抗体分子片段新型抗体分子V区C区CDRVHCH1CH2CH3VLCLC端L链H链N端（2）基因工程抗体类型V区C区CDRVHCH1CH2CH3V嵌合抗体（chimericantibody）：在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起。

人源化抗体（humanizedantibody）：又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）即将针对某种抗原的鼠源特异性抗体超变区代替人的Ig超变区，所产生的抗体几乎为人源的。鼠抗体人-鼠嵌合抗体

人源化抗体嵌合抗体（chimericantibody）：在基因水平上完全人源化抗体完全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。方法：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术、基因工程小鼠制备法、转染色体小鼠、抗体工程药物标联及增效技术完全人源化抗体抗体分子片段：抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv段,保留抗体上的抗原特异性结合区域,构建无Fc段、分子量较小、具抗原结合功能的分子片段的小分子抗体,其具有易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶,有利于肿瘤的诊断和治疗,免疫原性强,避免了Fc段与无关Fc受体结合所带来的副作用,可作为载体分子偶联多种活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的导向性治疗,且不需进行糖基化修饰,可在大肠杆菌中表达等特点。从而可改善其抗体的药代动力学特性,并适合于临床的应用。

抗体分子片段：抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv①单链抗体（singlechainFv，scFv）

②二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilizedFv，ds-Fv)ds-FvscFvVHVLVLVHds-FvscFvVHVLVLVH③单域抗体（singledomainantibody）及分子识别单位（molecularrecognitionunit,MRU）即单个V区抗体。④多价抗体（multivalenantibody）和多特异抗体（mulit-specificantibody）是指含有多个共价结合的Fv，具有一种或多种特异性的基因工程抗体。

多价FvFv多特异Fv③单域抗体（singledomainantibody）及新型抗体分子将抗体分子的部分片段与抗体无关的序列相连接，或利用其可变区特异结合抗原特性的同时发挥其它的生物学活性；或利用Ig分子的恒定区某些功能特点来加强与其结合的功能分子生物活性。

Fc新型抗体分子Fc抗原化抗体（antigenantibody,AgAb）将具有编码蛋白抗原表位的抗原基因片段植入抗体的超变区中，使肽链接近天然构象，可模拟抗原分子使机体产生相应抗体。抗原化抗体（antigenantibody,AgAb）AphagemidvectorPhagemidvectorcontainingaleadersequence,afragmentofthegeneexpressingphagecoatprotein3andM13originofreplication.基因工程抗体的获得常规的基因重组、表达技术通过转基因动物通过噬菌体抗体库技术AphagemidvectorPhagemidvect免疫学新技术及其临床应用讲稿课件单克隆抗体的临床应用

所治疗的疾病：肿瘤、免疫系统相关疾病、器官移植、感染、心血管疾病等针对的抗原：细胞膜分子（CD分子、膜受体及粘附分子、肿瘤相关抗原）、细胞因子、独特型、病毒单克隆抗体的临床应用免疫学新技术及其临床应用讲稿课件帕尼单抗（Panitumumab），即维克替比（Vectibix），安进公司帕尼单抗（Panitumumab），免疫学新技术及其临床应用讲稿课件国内已经获批生产的单抗产品公司名称商品名通用名适应症武汉生物制品研究所

注射用抗人T细胞CD3鼠单抗器官移植排异东莞宏逸士生物技术药业

抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏银屑病恩博克大连亚维药业

抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏银屑病上海中信国健药业益赛普注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白类风湿关节炎等上海美恩生物技术唯美生碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液肝癌治疗百泰生物药业泰欣生尼妥珠单抗注射液结直肠癌上海赛金生物医药强克注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白强直性脊柱炎上海中信国健药业健尼哌重组抗CD25人源化单克隆抗体注射液抗移植排斥国内已经获批生产的单抗产品公司名称商品名通用名适应症武2.酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗原或抗体吸附于聚苯乙烯反应板表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。通过级联放大作用，酶催化底物显色可进行定性、定量分析微量的抗体或抗原。常用于标记的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。灵敏度高，特异性好，操作简单，程序规范化。广泛用于临床疾病诊断。2.酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗原或抗体吸附于间接ELISA夹心ELISA竞争ELISA左图：酶标板、移液器；右图：酶标仪间接ELISA左图：酶标板、移液器；右图：酶标仪间接ELISA：用于检测液相中的抗体间接ELISA：用于检测液相中的抗体竞争ELISA：用来测定小分子抗原

夹心ELISA：测定二价或二价以上的大分子抗原竞争ELISA：用来测定小分子抗原

夹心ELISA：测定二价3.免疫印迹法（Western-blot）先将抗原经SDS电泳分开，再将分开的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，然后放入含有抗体的液体中，洗去未结合抗体，再加标记的二抗，通过显色或发光显示结果。3.免疫印迹法（Western-blot）先将抗原经SDS免疫学新技术及其临床应用讲稿课件4.免疫沉淀法某些情况下，凝胶分离和印迹过程中抗原会降解，有些抗原表位会破坏，无法和特异抗体结合，此时，用免疫沉淀法可鉴定与抗体结合的抗原。该技术可用于可溶性抗原，也可用于细胞表面抗原的分析。待检抗原用同位素标记，加入抗体，使两者特异结合，再加入共沉淀试剂，如proA等，使抗原抗体复合物沉淀下来，电泳后，固定胶经放射自显影，显现特异标记抗原所在的位置。4.免疫沉淀法某些情况下，凝胶分离和印迹过程中抗原会降解，免疫学新技术及其临床应用讲稿课件5.免疫组织化学用标记的已知抗体与组织或细胞表面抗原发生反应，结合形态学观察，对抗原进行定性、定位或定量检测的技术。常用方法：酶免疫组化（HRP等）免疫荧光技术（FITC、PE等）免疫金组化（胶体金）免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金等）5.免疫组织化学用标记的已知抗体与组织或细胞表面抗原发生反间接免疫荧光法检测抗核抗体（Hep2细胞）间接免疫荧光法检测抗核抗体（Hep2细胞）

免疫细胞的分离Ficoll的应用免疫磁珠分离技术流式细胞技术抗原特异性T细胞系的建立（二）细胞的分离和功能免疫细胞的分离（二）细胞的分离和功能

免疫细胞功能测定细胞增殖的检测：3H-TdR掺入法、CFSE效应细胞测定：ELISPOT细胞毒试验Tetramer技术细胞凋亡的检测：DNALadder、TUNEL、流式细胞技术（二）细胞的分离和功能免疫细胞功能测定（二）细胞的分离和功能1.淋巴细胞分层液（Ficoll）分离血细胞将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液（聚蔗糖-泛影葡胺）中即可配制成密度合适的分层液。不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。BeforecentrifugeAftercentrifugemononuclearcells1.淋巴细胞分层液（Ficoll）分离血细胞将适量340g2.免疫磁珠分离技术将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微珠上，与细胞悬液作用后置于磁场中，借磁力的作用将磁珠结合的细胞分开。2.免疫磁珠分离技术将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微免疫学新技术及其临床应用讲稿课件3.流式细胞技术3.流式细胞技术基本概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量基本概念原理原理流式细胞术的特点极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flowcytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞术的特点流式细胞仪的临床应用1.淋巴细胞免疫分型

淋巴细胞亚群分析2.细胞移植的交叉配型和免疫状态监测3.免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化检测细胞因子的检测CD4绝对计数、淋巴细胞CD4/CD8分析(HIV的诊断与研究)流式细胞仪的临床应用PE-CD19，FITC-CD3抗体检测淋巴细胞表型PE-CD19，FITC-CD3抗体检测淋巴细胞表型其他应用：如细胞凋亡的分析、血液病、肿瘤及其基因表达产物的检测、干细胞研究等。其他应用：4.T细胞系的建立4.T细胞系的建立5.细胞增殖的检测：3H-TdR掺入法、CFSE观察在有丝分裂原（PHA、ConA）或特异性抗原刺激下T细胞的增殖反应，测定细胞免疫功能。用3H-TdR法测T细胞增殖。5.细胞增殖的检测：3H-TdR掺入法、CFSE观察在有丝3H-TdR掺入法3H-TdR掺入法CFSE：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-car-boxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)是一种可穿过细胞膜的荧光染料,具有与细胞结合特异性的琥珀酰亚胺酯基团与具有非酶促水解作用的羧基荧光素二醋酸盐基团结合在一起可使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。细胞经CFSE染色后,在分裂增殖的过程中,标记的CFSE可平均分配到子代细胞中,使荧光在细胞分裂增殖过程中被逐渐稀释,因而荧光强度逐渐减弱。即在1个增殖的细胞群中,各连续传代细胞以荧光强度的1/2而递减为特征。CFSE广泛应用于淋巴细胞的增殖试验中。此外,它还可应用于细胞移植、细胞分裂周期的估算及细胞分选等方面。CFSE：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-car-免疫学新技术及其临床应用讲稿课件6.效应细胞测定：ELISPOT产生特异抗体的单个B细胞或分泌特异细胞因子的单个T细胞通过ELISPOT测定。测定抗体生成细胞，将淋巴细胞加入抗原致敏的板中。产生的特异性抗体即与抗体产生细胞邻近的抗原发生结合。利用偶联在抗免疫球蛋白上的酶和显色剂，结合抗体的斑点即可被检测。测定细胞因子产生细胞的板用抗细胞因子抗体包被，捕获的细胞因子用酶标记的抗细胞因子不同表位的抗体来测定。6.效应细胞测定：ELISPOT产生特异抗体的单个B细胞或免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件7.细胞毒试验

CTL细胞通常测定它们裂解靶细胞的能力（如病毒感染细胞、肿瘤细胞等）。靶细胞裂解可由铬释放试验测定。靶细胞和51Cr一起孵育，51Cr被摄入靶细胞与蛋白结合。孵育后，把靶细胞转至培养板与效应细胞共同培养4～16小时，取出上清，测量被效应细胞裂解的靶细胞释放的51Cr量。7.细胞毒试验

CTL细胞通常测定它们裂解靶细胞的能力（如铬释放细胞毒试验铬释放细胞毒试验8.Tetramer技术

Tetramer技术可以在离体细胞中测定抗原特异的CTL细胞，而无需体外扩增。TCR识别的MHC-肽复合物直接染色抗原特异T细胞。TCR与MHC-肽复合物亲和力低，迅速的解离无法进行直接染色。带有4个MHC-肽复合物的MHC四聚体可极大地增加对TCR的亲和力。将适当的MHC分子与一个肽段（BSP）融合，可作为生物素的底物，MHC-BSP和β2微球蛋白在E.coli中表达，与CTL的特异表位肽段混合，形成的MHC-肽段复合物被纯化获取。生物素化的复合物与荧光标记的亲和素以4:1比例混合产生四聚体。这些标记的四聚体与抗原特异CTL结合，通过FACS检测。8.Tetramer技术

Tetramer技术可以在离体细免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件9.细胞凋亡的检测细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检查Ladders实验流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病肿瘤9.细胞凋亡的检测细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的生理意义在于：确保细胞正常发育和生长；维持细胞内环境稳定；细胞发挥积极的防御功能。细胞凋亡和许多疾病密切相关：细胞凋亡不足：如肿瘤和自身免疫病；细胞凋亡过度：如心肌缺血、心力衰竭、神经元退行性疾病和病毒感染；凋亡不足与过度并存：如动脉粥样硬化。细胞凋亡的生理意义在于：细胞凋亡的主要表现细胞内酶改变：Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验凋亡相关蛋白：FasBcl-2细胞凋亡的主要表现(1)DNAladder凋亡细胞DNA可被核酸酶在核小体单位之间随机切断，产生180~200bp及其倍数的寡核苷酸片段，在琼脂糖电泳中呈现阶梯DNA区带图谱。(1)DNAladder凋亡细胞DNA可被核酸酶在核小体免疫学新技术及其临床应用讲稿课件(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling)在细胞培养物中加入末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl,TdT）和生物素标记的核苷酸（dUTP），TdT能在游离的DNA3’端缺口连接标记的核苷酸，利用生物素-亲和素-酶（荧光）放大系统，在DNA断裂处显色，可标示凋亡细胞。(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-b免疫学新技术及其临床应用讲稿课件(3)

流式细胞技术检测细胞凋亡凋亡细胞因核断裂，呈亚二倍体，用FACS分析亚二倍体数目，可指示细胞凋亡程度；因凋亡细胞的细胞膜受损，膜磷脂成分暴露，可与荧光标记的磷脂结合蛋白（AnnexinV)结合，用FACS分析，可检测悬浮细胞中凋亡细胞的频率。PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期细胞(3)流式细胞技术检测细胞凋亡凋亡细胞因核断裂，呈亚二倍体PIAnnexinV-FITCPIAnnexinV-FITC（三）分子功能检测转基因动物基因KnockoutRNAi技术（三）分子功能检测转基因动物1.转基因动物将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或胚胎细胞再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。1.转基因动物将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注方法显微注射法胚胎干细胞法逆转录病毒感染法精子载体法方法显微注射法对基因组织或阶段特异表达的研究通过新表型，发现基因的新功能通过突变表型，发现新基因用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究建立外源基因表达、调控的动物模型对遗传疾病的研究建立人类疾病的动物模型,进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法

动物新品种的培育作为医用或食用蛋白的生物反应器应用对基因组织或阶段特异表达的研究应用2.基因敲除基因敲除(Geneknockout)是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞（ES）这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,藉以揭示基因功能最直接的手段之一,因此成为后基因组时代的重要研究方法和内容。通过DNA同源重组，使得ES细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失，然后通过ES细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程。迄今为止,只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、效果最稳定,因此小鼠是目前基因敲除研究的唯一的实验动物模型。2.基因敲除基因敲除(Geneknockout)是借免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件意义基因敲除与多种疾病的研究基因敲除与生物制药意义基因敲除与多种疾病的研究3.RNAiRNAi是近年来才发现的一种古老的、保守的生物途径，是生物体适应外界环境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制，具有重大的生物学意义。

RNAi现已成为国内外研究的热点，被《Science》评为2002年最重大科技突破。2006年的Nobel医学和生理学奖授予了RNAi的提出者AndrewFire和CraigMello，从发现到获奖仅8年时间。随着对RNAi机制研究的深入和RNAi技术的不断完善，RNAi有望成为治疗病毒感染性疾病的新方法。3.RNAiRNAi是近年来才发现的一种古老的、保守的生物第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。

RNAi的作用机制第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNase第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。

第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶应用基因治疗：RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控异常的结果，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可以产生多个基因同时沉默。应用基因治疗：RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病研究基因的功能：由于RNAi可以特异性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功能基因组的研究（类似Geneknockout)。防御病毒的感染：RNAi具有对抗侵入性遗传因子（如病毒、转座子、转基因）的作用、打破其复制循环、减弱或消除其基因毒性作用。由于RNAi也存在于哺乳动物细胞中，RNAi或许可被利用来治疗病毒性疾病。研究基因的功能：由于RNAi可以特异性抑制特定的基因，获得考试题1.分别举自身免疫病实例阐述Th细胞、B细胞和CTL在组织损伤中的作用。2.何谓宿主抗移植物反应？阐述其临床分型及其发生机制？3.试述单克隆抗体在医学上的应用及其对免疫学发展的影响。4.考试（应激反应）后学生容易患感冒等病毒感染性疾病，（1）请运用免疫学知识和内分泌知识推测其原因，（2）检测哪些指标可以证明你的推测？5.任选一种已在临床上广泛使用的细胞因子，说明其应用范围及作用机制。6.肿瘤免疫的基本特征是什么？答题说明：请回答如下问题，并将答案以手写体完成于A4纸上（不可打印），注明姓名、学号和班级。答卷10月11日前交到校本部阶平楼292或291室。考试题1.分别举自身免疫病实例阐述Th细胞、B细胞和CTL免疫学检测新技术

及其临床应用

免疫学检测新技术

及其临床应用主要内容免疫学理论及技术研究和临床免疫学检测技术构成重要免疫学检测技术和新技术及其应用介绍主要内容免疫学理论及技术研究和临床一、免疫学理论及技术

研究和临床

一、免疫学理论及技术

研究和临床

1796年，爱得华•琴纳发明了牛痘疫苗从而保护人不得天花，WHO于1979年宣布天花灭绝。1796年，爱得华•琴纳发明了牛痘疫苗从而保护人不得天花，W免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件1082011年诺贝尔生理学或医学奖BruceA.BeutlerBorninUSAJulesA.HoffmannBorninLuxembourgRalphM.SteinmanBorninCanada证实Toll基因编码产物在识别病原微生物激活免疫反应中发挥了关键性作用发现LPS受体：一种Toll样受体发现树突细胞可激活T细胞引发免疫应答72011年诺贝尔生理学或医学奖BruceA.Beutl传染病预防疾病治疗免疫诊断免疫学理论及技术研究的临床意义传染病预防免疫学理论及技术研究的临床意义接种疫苗预防脊髓灰质炎©WHO

接种疫苗预防脊髓灰质炎©WHO免疫学新技术及其临床应用讲稿课件已批准上市的细胞因子多肽药物IFNα肝炎、白血病、AIDS、癌症IFNγ类风关，感染性疾病，慢性肉芽肿，过敏性皮炎G-CSF化疗导致的粒细胞减少症、再障、自身骨髓移植GM-CSF化疗导致的血细胞减少症、再障、自身骨髓移植EPO慢性肾衰所致贫血、癌症或癌症化疗所致贫血、失血后贫血IL-2癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂IFN-β多发性硬化症IL-11放化疗所致的血小板减少症SCF与G-CSF联合应用于外周血干细胞移植EGF烧伤、溃疡(外用药，在中国应用)βFGF烧伤、外周神经炎(外用药，在中国应用)已批准上市的细胞因子多肽药物IFNα肝炎、白血病、AIDS、可溶性IL-1R(吸入剂）哮喘可溶性IL-1R(注射剂）急性髓样白血病、类风湿关节炎可溶性IL-4R哮喘抗IL-4人源化抗体哮喘可溶性TNF-RII-Fc融合蛋白类风湿关节炎、慢性心衰可溶性TNF-RI-Fc融合蛋白休克、类风湿关节炎、多发性硬化症人源化抗EGF-R2单抗乳腺癌抗TNF-α单抗局限性肠炎人源化抗IL-8抗体银屑病细胞因子或其受体拮抗剂及其临床应用可溶性IL-1R(吸入剂）哮喘可溶性IL-1R(注射剂）急性二、免疫学技术构成二、免疫学技术构成基于抗原抗体反应的检测技术细胞免疫检测技术基于抗原抗体反应的检测技术抗原抗体反应的特点特异性一种抗原只能与其刺激机体产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性称特异性。可逆性抗原抗体主要通过分子表面的氢键、疏水键、静电和范得华力非共价结合。可见性在一定范围内，抗原抗体比例合适时，可出现肉眼可见的反应物。阶段性抗原抗体特异性结合阶段；反应可见阶段。抗原抗体反应的特点特异性第一抗体（一抗）：用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗体存在于血清中，这种抗体叫做一抗。第二抗体（二抗）：Ig具有同种型抗原特异性，将人Ig免疫动物，或将动物Ig免疫异种动物可制备出抗抗体，又称二抗。第一抗体（一抗）：用已知抗原免疫人或动物后，机体会产生特异性抗原抗体反应类型和检测方法凝集反应沉淀反应补体参加的反应免疫标记技术抗原抗体反应类型和检测方法凝集反应抗原抗体反应

凝集反应（颗粒性抗原）

沉淀反应（可溶性抗原）

补体参加的反应：溶血空斑实验

免疫标记技术直接凝集反应玻片凝集：ABO血型鉴定试管凝集：肥达反应间接凝集反应：直接/间接Coombs试验间接凝集抑制反应：免疫妊娠诊断试验单向免疫扩散：定量双向免疫扩散：检测复杂抗原抗体、半定量免疫电泳：血清蛋白及抗体成分分析免疫酶技术（酶标记）ELISA免疫组化：以组织或细胞为抗原间接法:已知抗原测抗体夹心法:已知抗体测抗原免疫荧光技术:荧光素标记同位素标记技术:同位素标记抗原抗体反应凝集反应沉淀反应补体参加的反应免疫细胞的分离外周血（人）淋巴细胞分层液单个核细胞玻璃粘附法单核细胞淋巴细胞尼龙毛、E花结淘选、磁珠、流式T细胞B细胞淘选、磁珠、流式T细胞亚群（利用T细胞表面CD分子）免疫细胞的分离外周血（人）淋巴细胞分层液单个核细胞玻璃粘附法免疫细胞功能测定淋巴细胞功能测定吞噬细胞功能测定T细胞增殖试验B细胞增殖试验：细胞毒试验3H-TdR掺入法MTT掺入法溶血空斑试验51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法凋亡细胞检测法形态学DNA-ladderTUNEL流式中性粒细胞趋化功能的测定中性粒细胞吞噬功能的测定巨噬细胞吞噬功能测定炭粒廓清试验鸡红细胞吞噬试验免疫细胞功能测定T细胞增殖试验B细胞增殖试验：细胞毒试验3H四、重要免疫学检测技术和新技术及其应用介绍四、重要免疫学检测技术和新技术及其应用介绍抗体作为工具的治疗和检测方法细胞的分离和功能分子功能检测

免疫学新技术及其临床应用讲稿课件（一）抗体作为工具的治疗和检测方法

抗体技术

ELISAWestern-blot

免疫沉淀免疫组织化学（一）抗体作为工具的治疗和检测方法抗体技术1.抗体技术抗体技术的发展经历了三个阶段第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体（单克隆抗体）第三代：基因工程抗体

1.抗体技术抗体技术的发展经历了三个阶段（1）单克隆抗体技术原理

(1)B细胞能产生抗体，但不易在体外培养；

(2)骨髓瘤细胞能在体内、外无限增殖，但不能分泌抗体；

(3)两者形成的杂交瘤细胞即能大量增殖，又能合成和分泌特异性抗体。（1）单克隆抗体技术原理单克隆抗体的制备

制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。

B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。单克隆抗体的制备免疫学新技术及其临床应用讲稿课件单克隆抗体与常规抗血清的性质比较

单克隆抗体与常规抗血清的性质比较（2）基因工程抗体类型嵌合抗体人源化抗体完全人源化抗体抗体分子片段新型抗体分子V区C区CDRVHCH1CH2CH3VLCLC端L链H链N端（2）基因工程抗体类型V区C区CDRVHCH1CH2CH3V嵌合抗体（chimericantibody）：在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起。

人源化抗体（humanizedantibody）：又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）即将针对某种抗原的鼠源特异性抗体超变区代替人的Ig超变区，所产生的抗体几乎为人源的。鼠抗体人-鼠嵌合抗体

人源化抗体嵌合抗体（chimericantibody）：在基因水平上完全人源化抗体完全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。方法：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术、基因工程小鼠制备法、转染色体小鼠、抗体工程药物标联及增效技术完全人源化抗体抗体分子片段：抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv段,保留抗体上的抗原特异性结合区域,构建无Fc段、分子量较小、具抗原结合功能的分子片段的小分子抗体,其具有易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶,有利于肿瘤的诊断和治疗,免疫原性强,避免了Fc段与无关Fc受体结合所带来的副作用,可作为载体分子偶联多种活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的导向性治疗,且不需进行糖基化修饰,可在大肠杆菌中表达等特点。从而可改善其抗体的药代动力学特性,并适合于临床的应用。

抗体分子片段：抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv①单链抗体（singlechainFv，scFv）

②二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilizedFv，ds-Fv)ds-FvscFvVHVLVLVHds-FvscFvVHVLVLVH③单域抗体（singledomainantibody）及分子识别单位（molecularrecognitionunit,MRU）即单个V区抗体。④多价抗体（multivalenantibody）和多特异抗体（mulit-specificantibody）是指含有多个共价结合的Fv，具有一种或多种特异性的基因工程抗体。

多价FvFv多特异Fv③单域抗体（singledomainantibody）及新型抗体分子将抗体分子的部分片段与抗体无关的序列相连接，或利用其可变区特异结合抗原特性的同时发挥其它的生物学活性；或利用Ig分子的恒定区某些功能特点来加强与其结合的功能分子生物活性。

Fc新型抗体分子Fc抗原化抗体（antigenantibody,AgAb）将具有编码蛋白抗原表位的抗原基因片段植入抗体的超变区中，使肽链接近天然构象，可模拟抗原分子使机体产生相应抗体。抗原化抗体（antigenantibody,AgAb）AphagemidvectorPhagemidvectorcontainingaleadersequence,afragmentofthegeneexpressingphagecoatprotein3andM13originofreplication.基因工程抗体的获得常规的基因重组、表达技术通过转基因动物通过噬菌体抗体库技术AphagemidvectorPhagemidvect免疫学新技术及其临床应用讲稿课件单克隆抗体的临床应用

所治疗的疾病：肿瘤、免疫系统相关疾病、器官移植、感染、心血管疾病等针对的抗原：细胞膜分子（CD分子、膜受体及粘附分子、肿瘤相关抗原）、细胞因子、独特型、病毒单克隆抗体的临床应用免疫学新技术及其临床应用讲稿课件帕尼单抗（Panitumumab），即维克替比（Vectibix），安进公司帕尼单抗（Panitumumab），免疫学新技术及其临床应用讲稿课件国内已经获批生产的单抗产品公司名称商品名通用名适应症武汉生物制品研究所

注射用抗人T细胞CD3鼠单抗器官移植排异东莞宏逸士生物技术药业

抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏银屑病恩博克大连亚维药业

抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏银屑病上海中信国健药业益赛普注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白类风湿关节炎等上海美恩生物技术唯美生碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液肝癌治疗百泰生物药业泰欣生尼妥珠单抗注射液结直肠癌上海赛金生物医药强克注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白强直性脊柱炎上海中信国健药业健尼哌重组抗CD25人源化单克隆抗体注射液抗移植排斥国内已经获批生产的单抗产品公司名称商品名通用名适应症武2.酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗原或抗体吸附于聚苯乙烯反应板表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。通过级联放大作用，酶催化底物显色可进行定性、定量分析微量的抗体或抗原。常用于标记的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。灵敏度高，特异性好，操作简单，程序规范化。广泛用于临床疾病诊断。2.酶联免疫吸附试验（ELISA）将已知的抗原或抗体吸附于间接ELISA夹心ELISA竞争ELISA左图：酶标板、移液器；右图：酶标仪间接ELISA左图：酶标板、移液器；右图：酶标仪间接ELISA：用于检测液相中的抗体间接ELISA：用于检测液相中的抗体竞争ELISA：用来测定小分子抗原

夹心ELISA：测定二价或二价以上的大分子抗原竞争ELISA：用来测定小分子抗原

夹心ELISA：测定二价3.免疫印迹法（Western-blot）先将抗原经SDS电泳分开，再将分开的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，然后放入含有抗体的液体中，洗去未结合抗体，再加标记的二抗，通过显色或发光显示结果。3.免疫印迹法（Western-blot）先将抗原经SDS免疫学新技术及其临床应用讲稿课件4.免疫沉淀法某些情况下，凝胶分离和印迹过程中抗原会降解，有些抗原表位会破坏，无法和特异抗体结合，此时，用免疫沉淀法可鉴定与抗体结合的抗原。该技术可用于可溶性抗原，也可用于细胞表面抗原的分析。待检抗原用同位素标记，加入抗体，使两者特异结合，再加入共沉淀试剂，如proA等，使抗原抗体复合物沉淀下来，电泳后，固定胶经放射自显影，显现特异标记抗原所在的位置。4.免疫沉淀法某些情况下，凝胶分离和印迹过程中抗原会降解，免疫学新技术及其临床应用讲稿课件5.免疫组织化学用标记的已知抗体与组织或细胞表面抗原发生反应，结合形态学观察，对抗原进行定性、定位或定量检测的技术。常用方法：酶免疫组化（HRP等）免疫荧光技术（FITC、PE等）免疫金组化（胶体金）免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金等）5.免疫组织化学用标记的已知抗体与组织或细胞表面抗原发生反间接免疫荧光法检测抗核抗体（Hep2细胞）间接免疫荧光法检测抗核抗体（Hep2细胞）

免疫细胞的分离Ficoll的应用免疫磁珠分离技术流式细胞技术抗原特异性T细胞系的建立（二）细胞的分离和功能免疫细胞的分离（二）细胞的分离和功能

免疫细胞功能测定细胞增殖的检测：3H-TdR掺入法、CFSE效应细胞测定：ELISPOT细胞毒试验Tetramer技术细胞凋亡的检测：DNALadder、TUNEL、流式细胞技术（二）细胞的分离和功能免疫细胞功能测定（二）细胞的分离和功能1.淋巴细胞分层液（Ficoll）分离血细胞将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液（聚蔗糖-泛影葡胺）中即可配制成密度合适的分层液。不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。BeforecentrifugeAftercentrifugemononuclearcells1.淋巴细胞分层液（Ficoll）分离血细胞将适量340g2.免疫磁珠分离技术将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微珠上，与细胞悬液作用后置于磁场中，借磁力的作用将磁珠结合的细胞分开。2.免疫磁珠分离技术将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微免疫学新技术及其临床应用讲稿课件3.流式细胞技术3.流式细胞技术基本概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量基本概念原理原理流式细胞术的特点极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flowcytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选流式细胞术的特点流式细胞仪的临床应用1.淋巴细胞免疫分型

淋巴细胞亚群分析2.细胞移植的交叉配型和免疫状态监测3.免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化检测细胞因子的检测CD4绝对计数、淋巴细胞CD4/CD8分析(HIV的诊断与研究)流式细胞仪的临床应用PE-CD19，FITC-CD3抗体检测淋巴细胞表型PE-CD19，FITC-CD3抗体检测淋巴细胞表型其他应用：如细胞凋亡的分析、血液病、肿瘤及其基因表达产物的检测、干细胞研究等。其他应用：4.T细胞系的建立4.T细胞系的建立5.细胞增殖的检测：3H-TdR掺入法、CFSE观察在有丝分裂原（PHA、ConA）或特异性抗原刺激下T细胞的增殖反应，测定细胞免疫功能。用3H-TdR法测T细胞增殖。5.细胞增殖的检测：3H-TdR掺入法、CFSE观察在有丝3H-TdR掺入法3H-TdR掺入法CFSE：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-car-boxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFSE)是一种可穿过细胞膜的荧光染料,具有与细胞结合特异性的琥珀酰亚胺酯基团与具有非酶促水解作用的羧基荧光素二醋酸盐基团结合在一起可使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。细胞经CFSE染色后,在分裂增殖的过程中,标记的CFSE可平均分配到子代细胞中,使荧光在细胞分裂增殖过程中被逐渐稀释,因而荧光强度逐渐减弱。即在1个增殖的细胞群中,各连续传代细胞以荧光强度的1/2而递减为特征。CFSE广泛应用于淋巴细胞的增殖试验中。此外,它还可应用于细胞移植、细胞分裂周期的估算及细胞分选等方面。CFSE：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5,6-car-免疫学新技术及其临床应用讲稿课件6.效应细胞测定：ELISPOT产生特异抗体的单个B细胞或分泌特异细胞因子的单个T细胞通过ELISPOT测定。测定抗体生成细胞，将淋巴细胞加入抗原致敏的板中。产生的特异性抗体即与抗体产生细胞邻近的抗原发生结合。利用偶联在抗免疫球蛋白上的酶和显色剂，结合抗体的斑点即可被检测。测定细胞因子产生细胞的板用抗细胞因子抗体包被，捕获的细胞因子用酶标记的抗细胞因子不同表位的抗体来测定。6.效应细胞测定：ELISPOT产生特异抗体的单个B细胞或免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件7.细胞毒试验

CTL细胞通常测定它们裂解靶细胞的能力（如病毒感染细胞、肿瘤细胞等）。靶细胞裂解可由铬释放试验测定。靶细胞和51Cr一起孵育，51Cr被摄入靶细胞与蛋白结合。孵育后，把靶细胞转至培养板与效应细胞共同培养4～16小时，取出上清，测量被效应细胞裂解的靶细胞释放的51Cr量。7.细胞毒试验

CTL细胞通常测定它们裂解靶细胞的能力（如铬释放细胞毒试验铬释放细胞毒试验8.Tetramer技术

Tetramer技术可以在离体细胞中测定抗原特异的CTL细胞，而无需体外扩增。TCR识别的MHC-肽复合物直接染色抗原特异T细胞。TCR与MHC-肽复合物亲和力低，迅速的解离无法进行直接染色。带有4个MHC-肽复合物的MHC四聚体可极大地增加对TCR的亲和力。将适当的MHC分子与一个肽段（BSP）融合，可作为生物素的底物，MHC-BSP和β2微球蛋白在E.coli中表达，与CTL的特异表位肽段混合，形成的MHC-肽段复合物被纯化获取。生物素化的复合物与荧光标记的亲和素以4:1比例混合产生四聚体。这些标记的四聚体与抗原特异CTL结合，通过FACS检测。8.Tetramer技术

Tetramer技术可以在离体细免疫学新技术及其临床应用讲稿课件免疫学新技术及其临床应用讲稿课件9.细胞凋亡的检测细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检查Ladders实验流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程HIV自身免疫性疾病肿瘤9.细胞凋亡的检测细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的生理意义在于：确保细胞正常发育和生长；维持细胞内环境稳定；细胞发挥积极的防御功能。细胞凋亡和许多疾病密切相关：细胞凋亡不足：如肿瘤和自身免疫病；细胞凋亡过度：如心肌缺血、心力衰竭、神经元退行性疾病和病毒感染；凋亡不足与过度并存：如动脉粥样硬化。细胞凋亡的生理意义在于：细胞凋亡的主要表现细胞内酶改变：Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验凋亡相关蛋白：FasBcl-2细胞凋亡的主要表现(1)DNAladder凋亡细胞DNA可被核酸酶在核小体单位之间随机切断，产生180~200bp及其倍数的寡核苷酸片段，在琼脂糖电泳中呈现阶梯DNA区带图谱。(1)DNAladder凋亡细胞DNA可被核酸酶在核小体免疫学新技术及其临床应用讲稿课件(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling)在细胞培养物中加入末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl,TdT）和生物素标记的核苷酸（dUTP），TdT能在游离的DNA3’端缺口连接标记的核苷酸，利用生物素-亲和素-酶（荧光）放大系统，在DNA断裂处显色，可标示凋亡细胞。(2)TUNEL（TdTdependentdUTP-b免疫学新技术及其临床应用讲稿课件(3)

流式细胞技术检测细胞凋亡凋亡细胞因核断裂，呈亚二倍体，用FACS分析亚二倍体数目，可指示细胞凋亡程度；因凋亡细胞的细胞膜受损，膜磷脂成分暴露，可与荧光标记的磷脂结合蛋白（AnnexinV)结合，用FACS分析，可检测悬浮细胞中凋亡细胞的频率。PI-Fluorescence#Events正常G0/G1期细胞(3)流式细胞技术检测