2.2.1动物细胞工程一动物细胞培养

细胞工程克隆动物多莉羊第2节

动物细胞工程希普：首例胚胎移植成功哈里森:首创动物组织体外培养法张明觉：发现哺乳动物精子获能现象格登、童第周：体细胞核移植成功试管家兔诞生米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术胚胎分割移植成功埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞克隆羊多莉诞生山中伸弥：获得诱导多能干细胞单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生我国科学家首次培育了体细胞克隆猴1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年科技探索之路动物细胞工程（含胚胎工程）的发展历程

在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。克隆皮肤动物细胞工程的概念动物细胞工程（animalcellengineering)其实就是应用细胞学的方法，按照我们人类的需要和预定的设计，有目的、有计划地保存、改变动物细胞和创造新的动物细胞，进而培育成新的物种或者品种的一门科学技术。克隆猴中中和华华动物细胞工程常用的技术：动物细胞培养是动物细胞工程的基础。动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植和生产单克隆抗体等。克隆皮肤“人造肉”的故事

荷兰生物学教授波斯特(M.post)手里的这份汉堡(图)有什么特殊之处吗？这份汉堡中的牛肉是波斯特把牛的骨细胞放在培养液中培育得到的。这种人工培育的牛肉能防止疯牛病病毒、口蹄疫病毒等动物病毒的感染。

第一个“能吃”的人造肉出现在2000年，美国杜鲁大学支持的生物科学研究联合体用金鱼细胞培养出了人造鱼肉。2001年，荷兰阿姆斯特丹大学的皮肤病专家韦特霍夫、内科医生艾伦和商人库顿宣布申请了制造人造肉的国际专利。他们的专利包括在肌肉细胞里加入胶原蛋白，然后把它们泡在营养液里，诱导它们分裂增殖.

2015年4月2日，荷兰马斯特里赫特大学的生理学教授MarkPost认为10年之内，人造牛肉除了和自然牛肉一样美味之外，在其它方面也将优于自然牛肉，从而解决当今牛肉生产面临的环境和动物保护问题。18个月前，他亲眼见证了首块牛肌肉干细胞制造的"人造牛肉"。2019年8月27日，肯德基和人造肉公司BeyondMeat合作，推出了第一款人造鸡肉产品。

2019年8月27日，肯德基和人造肉公司BeyondMeat合作，推出了第一款人造鸡肉产品。此次推出人造肉炸鸡，肯德基会先在亚特兰大的一家餐厅进行测试。产品包括黄金鸡块和

“人造肉”的获得利用的是什么技术？羽毛中提取细胞人造肉动物细胞培养技术无骨鸡翅。如果市场反响不错，肯德基会把它添加到正式菜单、并在全美推广。这意味着，肯德基有机会成为第一家在全美国提供植物人造肉炸鸡的快餐连锁。

美国马里兰大学的博士生贾森·马西尼在《组织工程学》杂志中撰文指出，他带领的一个研究小组已经找到了在实验室内制造"人造肉"的两种方法。一种方法是，他们首先从牛、猪、家禽或鱼的肌肉组织中提取细胞，在一个薄膜上进行培育。他们发现，细胞会生长、扩张，然后从薄膜上脱落；等到脱落后的平面细胞群堆积到一定厚度时，就形成了肉；马西尼提供的另一种方法是在一种三维颗粒中培育肌肉细胞。这样培育出的细胞组织可以用来制造肉制品，比如鸡米花和碎牛肉。

这一种人造肉，是科学家利用干细胞培育出"肉"。培养"人造肉"属于医学上的组织工程学的范畴，到目前为止，科学家们只能培育出指甲盖大小的骨骼肌。对于人造肉，有人担心在未来的某一天会在超市里吃到培养出的"人肉"。一.动物细胞培养（一）概念

动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。（二）动物细胞培养的条件2.体外培养动物细胞需要满足的条件

动物体内的细胞之所以能够维持正常的生命活动，有些细胞还有不断的增值，是因为机体给这些细胞提供了适宜的条件，包括充足的营养、稳定的内环境等。糖类、氨基酸、无机盐、维生素……无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境1.动物细胞体内生命活动和增殖需要的条件动物体组织单个细胞细胞生长和增殖取出分散适宜条件①合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基称为合成培养基。②血清等一些天然成分：血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子（含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求）。细胞培养时，一般需添10%～20%的血清或血浆。（1）营养一般使用液体培养基，也称为培养液（合成培养基+血清等一些天然成分）。血清为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？1.血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。2.氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。3.血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，这是细胞生长和增殖所必需的，能促进细胞的生长、增殖和贴附。4.因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。（2）无菌、无毒的环境①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理。②在无菌环境下进行操作。培养液需要定期更换

更换培养液的目的是清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。③在细胞培养液中添加一定量的抗生素抑制细菌生长。防止培养过程中的微生物污染。无菌环境：无毒环境：①适宜的温度：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜②适宜的pH：多数细胞生存的适宜pH为7.2-7.4③适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。（3）温度、PH和渗透压人体的理化性质数值？（4）气体环境①气体的组成及作用95%空气（O2）5%CO2②培养装置:培养皿或松盖培养瓶（含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱。）置于维持培养液的pH细胞代谢所必需CO2培养箱中进行培养CO2培养箱（三）动物细胞培养的过程动物细胞培养的原理是细胞增殖，目的是获得细胞或细胞产物。

胚胎或幼龄动物的组织或器官。比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越容易培养。1.取材：2.动物细胞培养的过程取动物组织用机械法

或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理分散成单个细胞解决悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等接触抑制传代培养细胞悬液原代培养分瓶培养加培养液在培养皿或培养瓶内悬浮培养的细胞:直接用离心法收集贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集细胞分裂受阻②制成细胞悬液，分瓶培养①收集细胞原代培养

培养传代培养

取动物组织制成细胞悬液

CO2培养箱

培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞分化程度低，增殖能力强去掉组织间蛋白细胞贴壁过程圆球形细胞刚开始铺展贴壁生长（100×）培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×）细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×）贴壁生长与接触抑制②细胞接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。相关生物学名词①细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。③原代培养：指动物组织经处理后的初次培养。④传代培养：分瓶后的细胞培养。⑤细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。⑥细胞系：传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。细胞悬浮液细胞株10代细胞50代细胞细胞系无限传代原代培养传代培养遗传物质改变原代培养、传代培养、细胞株、细胞系四者之间的关系例如：如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线，图中B、E两点表示经筛选、分装后继续培养。据图分析：(1)原代培养和传代培养的分界点是哪个？(2)AB段和DE段繁殖速度缓慢的原因是什么？(3)E点后的细胞大多数具有异倍体核型，这样的细胞有什么特点？B点之前的培养称为原代培养，之后的培养称为传代培养。AB段发生了接触抑制；DE段细胞大部分衰老失去分裂能力。E点后的细胞属于细胞系，能无限增殖。（1）培养前为什么分散成单个细胞？①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖；②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。（3）将组织分散成单个细胞时为什么要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理？胃蛋白酶可以吗？

胰蛋白酶可以将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞。纤维蛋白、胶原蛋白等（4）在用胰蛋白酶处理组织时应注意什么？

细胞膜含有蛋白质，胰蛋白酶（适宜pH为7.2～8.4）在此环境中活性较高，但酶的浓度、处理时间要控制好，否则会损伤细胞。

不可以；多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4，而胃蛋白酶的适宜pH约为2，在此环境中会失活。

（2）动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶？第一次使用的目的是使组织细胞分散开；

贴壁细胞传代培养时使用的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶后继续培养。（5）悬浮生长细胞和贴壁生长细胞培养过程有什么不同？悬浮生长类细胞：原代培养→分裂受阻→离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。贴壁生长类细胞：原代培养→分裂受阻→先胰蛋白酶处理→再离心法收集→制成细胞悬液→传代培养。（7）需分瓶进行传代培养的原因？（6）贴壁培养的细胞具有什么特点？

细胞贴壁、接触抑制

①细胞密度过大；②有害代谢物积累；③营养物质缺乏；④接触抑制（贴壁细胞）。导致细胞分裂受阻。细胞的接触抑制要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附）悬浮培养瓶（8）植物组织培养与动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理（及是否体现细胞全能性）

（

全能性）

（

全能性）培养基

培养基

培养基过

程外植体↓脱分化

↓再分化芽、根或胚状体↓生长发育植物体动物的组织机械法↓或酶处理细胞悬液↓

↓细胞悬液↓

结

果

相同点①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂；②均需要无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件。植物细胞的全能性体现细胞增殖未体现固体液体愈伤组织原代培养传代培养新的植物体新的细胞群动物细胞培养过程总结动物胚胎或幼龄动物的组织、器官配置细胞悬液剪碎用胰蛋白酶处理10代细胞转入培养瓶40-50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液稀释传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）为什么用胰蛋白酶处理？分瓶传代培养原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。细胞株：一般说遗传物质未改变细胞系：遗传物质已改变原代培养（四）干细胞培养及其应用1.干细胞的概念：动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞即为干细胞，在一定的条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞。2.干细胞来源：干细胞存在于早期细胞、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。3.干细胞的类型：胚胎干细胞、成体干细胞。（1）胚胎干细胞（简称ES细胞）存在于早期胚胎（8细胞期之前含8细胞期）中；

具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。

ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等。（2）成体干细胞

成体干细胞是成体组织或器官内的干细胞，包括骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞和睾丸中的精原干细胞等。

成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。

造血干细胞属于成体干细胞，主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中。

造血干细胞——多潜能干细胞神经干细胞——单能干细胞

（1）通过正常的造血干细胞的移植可以恢复病人的造血和免疫功能，治疗白血病、一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统和免疫系统功能障碍等疾病、遗传性血液病（如地中海贫血、血液再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。T淋巴细胞造血干细胞巨噬细胞红细胞

B淋巴细胞血小板肥大粒细胞嗜中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞（3）自体器官移植

4.干细胞的应用：（2）神经干细胞可治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）

人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植。

干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。理论上可以避免免疫排斥反应。（4）揭示细胞分化和细胞凋亡的机理。（5）用于对哺乳动物个体发生和发育规律的研究。（6）诱导多功能干细胞（iPS细胞）。临床治疗人类疾病如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞移植回病人体内(五）动物细胞培养的意义（1）生物制品：酶、生长因子、疫苗、单克隆抗体等；（2）进行有毒物质和药物的检测；（3）临床治疗：人工皮肤；（4）生物学基础研究：细胞全能性的揭示、细胞周期及调控、癌变机理及细胞衰老的研究。细胞培养板通过细胞培养检测有毒物质研发病毒疫苗干扰素一、概念检测练习与应用P471.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。（1）培养环境中需要O2，不需要CO2。（

）（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（

）（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（

）（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（

）√√××2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是()A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞B.造血干细胞可以分化