总RNA提取及免疫组化课件

细胞总RNA的提取2015-07-21一、真核细胞的总RNA1、mRNA:1-5%

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大亚基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亚基40S:18S=1874nt二、RNA提取的注意事项

RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。

1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.

一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处理后）高压灭菌。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。

RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。2)加入200l氯仿，震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。3)10000rpm，离心5min。RNA(清澈透明)DNAProtein4)将清澈透明的上层水相转移至另一离心管中。三、RNA提取的实验操作

5)沉淀RNA：加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm，离心10min。弃上清。6)加1ml

75%乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)7)7500rpm离心1min，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。8)室温干燥3－5min。（干燥的时间由RNA沉淀大小决定）（干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项：RNA:避免放在37C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNApellet：透明胶样干燥后应该无色透明9）RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O

20-30l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。10)吸出2-3

l溶液放到冰上备用(将用于电泳)。11)剩余溶液放到冰上备用（将用于RT－PCR）。注意：

RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。RNA电泳结果rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。

RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。免疫组化的原理及流程介绍2015-07-21免疫组化的原理应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。免疫组化原理及流程介绍直接法TissueAntigenLabeledAntibody将荧光、酶直接标记在一抗上优点：简单方便缺点：灵敏度低每种一抗都需要进行标记免疫组化原理及流程介绍直接法间接法TissueAntigenPrimaryAntibodySecondaryAntibody将荧光、酶等标记在二抗上优点：灵敏度高只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应

免疫组化原理及流程介绍间接法免疫组化—SP法SP法--链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法

（streptavidin-peroxidase）一抗生物素标记的二抗Streptavidin-HRP（HRP标记的链霉亲和素）简化实验步骤减少非特异性背景免疫组化原理及流程介绍免疫组化—SP法ABC法(AvidinBiotin-peroxidaseComplex)一抗生物素标记的二抗Avidin-Biotin-HRPComplex（亲和素-HRP标记的生物素）亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的灵敏度。免疫组化—ABC法免疫组化原理及流程介绍免疫组化—ABC法免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

60℃×20min→Xylene：2×10minutes；100%absoluteethanol：2×5minutes；95%ethanol2minutes；80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；PBS洗3×3min。具体操作免疫组化原理及流程介绍(2)封闭内源性过氧化酶其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。1)用封闭通透液浸润切片30min（RT避光）。其配法是用预热40mlPBS加120ulTritonX-100加热几分钟，在临用前加400ul的30％H2O2。2)PBS溶液洗3次×3min。免疫组化原理及流程介绍具体操作:免疫组化原理及流程介绍常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。抗原修复的主要方法:酶消化方法一般用于细胞内抗原应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键免疫组化原理及流程介绍将切片放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约4次，每次间隔补足液体，防止干片。2)PBS溶液洗3次×3min。具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍4.封闭特异性蛋白组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。

免疫组化原理及流程介绍5.一抗孵育一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，冰箱中取出后需37℃复温45min。

免疫组化原理及流程介绍具体做法：免疫组化原理及流程介绍6.二抗孵育二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。免疫组化原理及流程介绍1)将一抗倒掉并用PBS洗5min×5次；2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37℃恒温烤箱中30min。3)用PBS洗5次×5min免疫组化原理及流程介绍具体操作：7.SP反应SP染色法即链霉素抗生物素蛋白生物素过氧化酶连接法。该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO基。

免疫组化原理及流程介绍1）加入SP复合液后放入37度烤箱中30min。2）用PBS洗5次×5min。具体操作：SP染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。免疫组化原理及流程介绍8.显色

在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。免疫组化原理及流程介绍通常在过氧化物酶（HRP）法中，显色剂为DAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)配法:DAB50mg0.05MTB100ml30%H2O230-40ulABC法SP法PAP法免疫组化原理及流程介绍9、复染、脱水、透明、封片复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。1)用PBS3次×3min后，用双蒸水洗5min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20s），自来水冲洗，双蒸水洗5min，再用PBS返蓝5min。2)脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absoluteethanol:(1-2)min；100%absoluteethanol:(1-2)min。3)透明：Xylene1×(1-2)min→Xylene2×(1-2)min4)封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。免疫组化原理及流程介绍1．阳性染色特点①Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色细胞与组织无区别）②染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色弥散性均匀）。★须从以下几个方面综合评价：2．组织切片制作过程的影响①固定不良—非特异性染色，显示不均。②边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。免疫组化原理及流程介绍3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片。免疫组化原理及流程介绍注意事项：3.以下原因可能导致片子着色不均匀：①脱蜡不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鲜的二甲苯中；②水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；③抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；④抗体孵育时，切片放倾斜；⑤抗体孵育后PBS冲洗不充分。