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抗生素生产工艺

1、抗生素概述

抗生素是青霉素、链霉素、红霉索等一类化学物质的总称。它是生物，包括微生物、植物和动物，在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物质。

抗生素的生产目前主要用微生物发酵法进行生物合成。很少数抗生素如氯霉素、磷霉素等亦可用化学合成法生产。此外还可将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法进

行分子结构改造而制成各种衍生物，称半合成抗生素，如氨苄青霉素(ampicillin)就是半合成青霉素的一种。

随着对抗生素合成机理和微生物遗传学理论等的深入研究，了解到它是属于次级代谢产物(Secondarymetabolite)。

2、抗生素的发展

抗生素学科的发展是劳动人民长期来与疾病进行斗争的结果，也是随着人类对自然界中微生物的相互作用，尤其是对微生物之间的拮抗现象的研究而发展起来的。19世纪70年代，法国的Pasteur发现某些微生物对炭疽杆菌有抑制作用。他提出了利用一种微生物抑制另一种微生物现象来治疗一些由于感染而产生的疾病。1928年英国细菌学家Flemling发现污染在培养葡萄球菌的双碟上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。他此霉菌分离纯化后得到的菌株经鉴定为点青霉(Penicilliumnotatum)，并将这菌所产生的抗生素命名为青霉素。1940年英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。经实验和临床试验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的好多疾病有卓越的疗效。在此基础上1943—1945年间发展了新兴的抗生素工业。以通气搅拌的深层培养法大规模发酵生产青霉素。随后链霉素、氯霉素、金霉索等品种相继被发现并投产。

从50年代起许多国家还致力于农用抗生素的研究。如杀稻瘟素(BlasticidinA),春日霉素(kasugamycin)，灭瘟素S、井岗霉素等高效低毒的农用抗生素相继出现。70年代以来，抗生素品种飞跃发展。到目前为止，从自然界发现和分离了4300多种抗生素，并通过化学结构的改造，共制备了约三万余种半合成抗生素。3、抗生素的分类随着新抗生素的不断出现，需要将抗生素进行分类，以便于研究。今简要将常见的分类方法列述如下：A、根据抗生素的生物来源分类微生物是产生抗生素的主要来源。其中以放线菌产生的为最多，真菌其次细菌的又次之，而来源于动、植物的最少。

(1)放线菌产生的抗生素

在所有已发现的抗生素中，由它产生的抗生素占一半以上，其中又以链霉菌属产生的抗生素为最多。诺卡氏菌属、小单抱菌属次之。这类抗生素中主要有氨基糖苷类，如链霉素；四环类，如四环素；大环内酯类，如红霉素；多烯类，如制霉菌素；放线菌素类，如放线菌素D等。(2)真菌产生的抗生素

在真菌的四个纲中，不完全菌纲中的青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素，如青霉素、头孢菌素。其次为担子菌纲。藻菌纲和子囊菌纲产生的抗生素很少。

B、根据抗生素的作用分类按照抗生素的作用，可以分成以下类别：(1)广谱抗生素

如氨苄青霉素，它既能抑制革兰氏阳性菌，又能抑制革兰氏阴性菌。(2)抗革兰氏阳性菌的抗生素

如青霉素等。(3)抗革兰氏阴性菌的抗生素

如链霉素等。(4)抗真菌抗生素

如制霉菌素等。(5)抗病毒抗生素

如四环类抗生素对立克次体及较大病毒有一定作用。(6)抗癌抗生素

如阿霉素(adria2mycin)等。C、根据抗生素的化学结构分类由于化学结构决定抗生素的理化性质、作用机制和疗效，故按此法分类具有重大意义。但是，许多抗生素的结构复杂，而且有些抗生素的分子中还含有几种结构。故按此法分类时，不仅应考虑其整个化学结构，还应着重考虑其活性部分的化学构造，现按习惯法分类如下：(1)β—内酰胺类抗生素包括青霉素类、头孢菌素类等。它们都包含一个四元内酰胺环。(2)氨基糖苷类抗生素

包括链霉素、庆大霉素等。它们既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇的结构。(3)大环内酯类抗生素

如红霉素、麦迪霉素(medicamycin)。它们含有一个大环内酯作配糖体，以苷健和1-3个分子的糖相连。

D、根据抗生素的作用机制分类．根据抗生素对致病菌作用的机制，可分成五类：(1)抑制细胞壁合成的抗生素

如青霉素、头孢菌素。(2)影响细胞膜功能的抗生素

如多烯类抗生素。(3)抑制蛋白质合成的抗生素

如四环素。(4)抑制核酸合成的抗生素

如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。(5)抑制生物能作用的抗生素如抑制电子转移的抗霉素(antimycinl)。

E、根据抗生素的生物合成途径分类(1)氛基酸、肽类衍生物

如青霉素、头孢菌素等寡肽抗生素。(2)糖类衍生物

如链霉素糖苷类抗生素。(3)以乙酸、丙酸为单位的衍生物

如红霉素等丙酸衍生物。

对医用抗生素的评价应包括以下要求：1)它应有较大的差异毒力，即对宿主人体组织或正常细胞只是轻微毒性而对某些致病菌或突变肿瘤细胞有强大的毒害。2)它能在人体内发挥其抗生效能而不被人体中血液、脑脊液等所破坏，同时它不应大量与体内血清蛋白产生不可逆的结合。3)在给药后应较快地被吸收，并迅速分布至被感染的器官或组织中。4)致病菌在体内对该抗生素不易产生耐药性。5)不易引起过敏反应6)具备较好的理化性质和稳定性,以利于提取、制剂和贮藏。

(2)抗生素的剂量单位

抗生素除了以重量作为剂量单位外，更常用特定的效价单位。如一个青霉素效价单位为能在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量；一个链霉素效价单位为能在1ml肉汤培养基基中完全抑制大肠杆菌标准菌株所需的最小链霉素剂量。在抗生素已能被制成纯净的化学物质时，就可用重量来表示单位，例如1mg青霉素钠盐相当于1667个单位；1mg链霉素碱相当于1000个单位等。

B、抗生素在农牧业中的应用不少农用抗生素作用强、剂量小、且不易引起环境污染，故受到欢迎。如春日霉素(Kasugamycin)对防治稻瘟病很有效。在畜牧业中可用以治疗和预防牲畜的疾病，以及作为幼畜、幼禽的生长刺激剂。在兽医临床上已使用的抗生素有四环类、杆菌肽等。

5、抗生素生产的工艺过程现代抗生素工业生产过程如下：菌种→孢子制各→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装

A、菌种从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱(-190℃~-196℃)内保存。所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。

B、孢子制备生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。

制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，将其接种到灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5-7日或7日以上。为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可在固体培养基上扩大培养。

接种量一般相当于0.1%—2%(接种量的%，系对种子罐内的培养基而言)。从一级种子罐接入二级种子罐接种量一般为5%-20%，培养温度一般在25-30℃。如菌种系细菌，则在32-37℃培养。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气,控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定发酵单位和进行生化分析等，并观察无杂菌情况。D、培养基的配制在抗生素发酵生产中，1)各菌种的特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。2)同一菌种，在不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。因此需根据其不同要求来选用培养基的成分与配比。其主要成分包括碳源、氮源、无机盐类和前体等。

(2)氮源

主要用以构成菌体细胞物质(包括氨基酸、蛋白质、核酸)和含氮代谢物。有机氮源中包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉,玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和菌丝体等。无机氮源中包括氨水,硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨等。在含有机氮源的培养基中菌丝生长速度较快，菌丝量也较多。

(3)无机盐和微量元素

抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要某些无机盐类和微量元素。如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓度与菌种的生理活性有一定影响。因此，应选择合适的配比和浓度。此外，在发酵过程中可加入碳酸钙作为缓冲剂以调节pH。

(4)前体

在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质，称为前体(precursor)。前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。如苯乙酸成苯乙酰胺可用作为青霉素发酵的前体。丙醇或丙酸可作为红毒素发酵的前体。此外，有时还需要加入某种促进剂或抑制剂，如在四环素发酵中加入M-促进剂和抑制剂溴化钠，以抑制金霉索的生物合成并增加四环素的产量。

(5)培养基的质量

培养基的质量应予严格控制，以保证发酵水平，可以通过化学分析，并在必要时作摇瓶试验以控制其质量。此外，如果在培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质。E、发酵

发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。接种量一般为10%或10%以上，在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧，在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。此外，还要加入消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的PH。有的品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。F、发酵液的过滤和预处理发酵液的过滤和预处理其目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。(1)发酵液的预处理发酵液中的杂质如高价无机离子(Ca+2、Mg+2、Fe+3)和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸附。a对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。如加磷酸(或磷酸盐)，则既能降低钙离子浓度，也易于去处镁离子。Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+Na+如加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。2K4Fe(CN)6+3ZnSO4→K2Zn3[Fe(CN)6]2↓+3K2SO4

b

对于蛋白质，利用等电点将其去除。蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，属于两性物质，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷，而在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。

c对热稳定的抗生素发酵液还可用加热法。使蛋白质变性、发酵液粘度降低、加快滤速。例如在链霉素生产中加入草酸或磷酸将发酵液调至pH3.0左右，加热至70℃，维持约半小时，用此方法来去除蛋白质，这样滤速可增大10-100倍。滤液粘度可降低至1/6。为了更有效地去除发酵液中的蛋白质，还可以加入絮凝剂。絮凝剂的加入使胶体溶液电荷性质改变从而使溶液中蛋白质絮凝。对絮凝剂的结构要求：1)其分子中必须有相当多的活性基团，能和悬浮颗粒表面相结合。2)必须具有长链线性结构，以使其有较好的溶解度。

(2)发酵液的过滤

发酵液为非牛顿型液体、很难过滤。过滤如用板框压滤则劳动强度大，影响卫生，菌丝流入下水道时还影响污水处理。故以选用鼓式真空过滤机为宜，并在必要时在转鼓表层涂以助滤剂硅藻土。当转数旋转时，以刮刀将助滤剂连同菌体薄薄刮去一层，以使过滤面不断更新。

另一种设备是自动出渣离心机，但所排出的菌丝滤渣中尚含有较大量的发酵液，因此如要提高过滤收率，可将此滤渣以水洗后离心分离。再一种设备称倾析器(Decanter)。它既可用于固、液相的分离，也可用于固相、有机溶媒相和水相三者的混合和分离。G、抗生素的提取

提取时目的是在于从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。在发酵滤液中杂质中有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热原质、或有毒性物质等。

由于多数抗生素不稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：1)时间短；2)温度低；3)pH宜选择对抗生素较稳定的范围；4)勤清洗消毒。常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。(1)溶媒萃取法

抗生素在不同pH条件下，在水与溶媒中溶解度不同，利用此原理就可调节pH的办法使抗生素从发酵滤液转移到有机溶媒中去，以达到浓缩和提纯的目的。所选用的溶媒与水应是互不相溶，同时溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性。目前一些重要的抗生素，如青霉素、红霉素和林可霉素等均采用此法进行提取。

(2)离子交换法

原理：利用抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。此法具有成本低、设备简单、操作方便，已成为提取抗生素的重要方法之一。如链霉菌素、庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素等均可采用离子交换法。此法在生产过程中PH变化较大，不适用于稳定性较差的抗生素等。

3)其他提取方法

如直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的一种。例如四环类抗生素的提取即可用此法。发酵液在用草酸酸化后，加黄血盐、硫酸锌，过滤后得滤液，然后以脱色树脂脱色后，直接将其PH调至等电点后使其游离碱折出。H、抗生素的精制

这是抗生素生产最后工序。对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范。(即GMP)的规定。下面对抗生素精制中可选用的步骤分述如下：A脱色和去热原质脱色和去热原质是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。色素往往是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。热原注入体内引起恶寒高热，严重的引起休克。热原质是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水。在280℃加热4h它能被破坏90%；180-200℃加热半小时或150℃加热2h能被彻底破坏。热原质能通过一般滤器，但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。生产中常用活性炭脱色去除热原，也可用脱色树脂去除色素(如酚醛树指，即122树脂)。对某些产品可用超微过滤法去除热源。

B结品和重结晶

抗生素精制常用此法来制得高纯度成品。常用的几种结晶方法如下：(1)改变温度结晶

利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。例如制霉菌素的浓缩液在5℃条件下保持4-6h后即结晶完全。分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。

(2)利用等电点结晶

将抗生素溶液的pH调到等电点时,它溶解度最小，则沉淀析出。如6-氨基青霉烷酸(6-APA)水溶液当PH调至等电点(4.3)时，6-APA即从水溶液中沉淀析出。(3)加成盐剂结晶在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结品。例如在青霉素G或头孢菌素C的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。

(4)加入不同溶剂结晶

利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出。如巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性质。在其浓缩液中加入10-12倍体积的95%乙醇，并调PH至7.2-7.3使其结晶析出。重结晶是进一步精制以获高纯度抗生素的有效方法．

C其他精制方法

其他精制方法包括：(1)共沸蒸馏法

如青霉素可用丁醇或醋酸丁酯以共沸蒸馏进行精制。(2)柱层析法

如丝裂霉素A、B、C三种组分可以通过氧化铝层析来分离。(3)盐析法

如在头孢噻吩水溶液中加入氯化钠使其饱和，其粗晶即被析出后进一步精制。(4)中间盐转移法

如四环素碱与尿素能形成复盐沉淀后再将其分解，使四环素碱析出。用此独以除去4-差向四环素等异物，以提高四环素质量和纯度，又如红霉素能与草酸或乳酸盐或复盐沉淀等。(5)分子筛

如青霉素粗品中常含聚合物等高分子杂质，可用葡聚糖凝胶G—25(粒度20—80μm）将杂质分离掉。此法仅用于小试验。

I、抗生素生产实例以青霉素生产工艺为例，作简要介绍：A菌种常用菌种为产黄青霉素(Penchrysogenum)。当前生产能力可达30000-60000μ／mL。按其在深层培养中菌丝的形态，可分为球状菌和丝状菌。常用的丝状菌为代表将其生产流程描述如下：B发酵工艺发酵工艺流程：冷冻管→斜面母瓶→大米孢子→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐→放罐→至提炼。C培养基培养基包括：(1)碳源

青霉素能利用多种碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前普通采用淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液(DE值50%以上)进行流加。

(2)氮源

可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸质粉，并补加无机氮源。(3)前体

为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉菌有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。(4)无机盐

包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30μm以下。D发酵培养控制发酸培养控制包括：(1)青霉素产生菌生长发育可分为下面六个阶段：Ⅰ期：分生孢子发芽。孢子先膨胀再形成小的芽管，此时原生质未分化，具有小空孢。Ⅱ期

菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，在Ⅱ期末有类脂肪小颗粒。Ⅲ期

形成脂肪粒，积累贮藏物。原生质嗜碱性仍很强。Ⅳ期

脂肪粒减少，形成中、小空孢子。原生质嗜碱性弱。

Ⅴ期

形成大空孢子其中含有一个或数个染色的大颗粒。脂肪粒消失。

Ⅵ期

细胞内看不到颗粒，并出现个别自溶的细胞。其中I一Ⅳ期初称菌丝生长期。产生青霉素较少，而菌丝浓度增加很多。Ⅲ期适于作发酵用种子。Ⅳ一Ⅴ期称青霉素分泌期，此时菌丝生长趋势渐减弱。大量产生青霉素。Ⅵ期即菌丝自溶期，菌体开始自溶。

(2)加糖控制

加糖的控制系根据残糖量及发酵过程中的pH。一般在残糖降至0.6%左右上升时开始加糖。(3)补氮及加前体

补氮是指加硫酸铵、氨或尿素，使发酵液，氮控制在0.01%-0.05%。补前体以便发酵液中苯乙酰胺