基因工程原理

1、分支杆菌菌种鉴定研究进展摘 要：由于全球范围内肺结核及非结核分支杆菌病的发病呈逐年上升趋势, 准确 而快速的菌种鉴定技术对结核病的诊断和鉴别诊断及有效化疗都有极其重要的 意义。目前国内外采用传统的分支杆菌菌种鉴定方法需依据细菌生长速度、色素 产生及多种生化试验等结果综合分析才能获得结果; 而 BACTECTB460、TB960 培 养基系统虽快(2-6d),但只能初步鉴定结核分支杆菌复合群和非结核分支杆菌， 不能将细菌鉴定至种。近年来建立的色谱方法虽能达到部分菌种鉴定的目的, 但 需特殊仪器, 临床尚未普遍采用。目前国内外研究者都致力于使分支杆菌菌种鉴 定从细胞表型水平进入分子基因水平。现对分

2、支杆菌分子菌种鉴定方法的研究进 展综述。关键词：分支杆菌，DNA，基因芯片技术，PCRPCR-DNA测序技术 此方法是检测结核分支杆菌特异性核苷酸序列最直接可靠的方法, 而不对称PCR技术可直接测出ssDNA序列。Soini等报道用该方法通过PCR扩增分支杆 菌属的基因片段,能鉴别鸟、胞内分支杆菌,堪萨斯、戈登和马尔摩分支杆菌均显 示特异的核苷酸序列。此方法虽准确可靠, 但操作繁杂, 需测序仪器, 实验费用昂 贵, 限制了其在临床上的应用。基因芯片技术基因芯片技术是近年来发展的一种大规模评价基因多样性的新技术,该方法 是在小型玻璃介质精确位点上进行分子杂交, 已成功地用于基因表达监测、突变 基

3、因的筛选以及几种人基因和病毒基因的多态性研究。1998年Gingeras等基 于 rpoB 基因序列在检测结核分支杆菌耐利福平菌株的同时鉴定了 10 种不同菌 种的临床分离株。1999年Troesch等基于16SrRNA和rpoB基因序列，利用基 因芯片技术鉴定出70株27 种不同菌种的分支杆菌临床分离株,其中偶然分支杆 菌、猿猴分支杆菌、耻垢分支杆菌、结核分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、鸟分支杆菌 复合群等19种菌株得以准确鉴定,但4株传统表型方法鉴定为鸟分支杆菌分离株 中有 1 株用基因芯片技术鉴定为胞内分支杆菌, 另 4 株胞内分支杆菌分离株中有 1株用基因芯片技术鉴定为鸟/副结核分支杆菌。由此

4、可见,基因芯片技术可以快 速准确鉴定大量的 DNA 序列,解决了传统菌种鉴定耗时烦琐的问题,但两种鉴定 结果存在一些分歧, 需进一步研究, 并且几个菌种显示大量 16SrRNA 或 rpoB 等 位基因。所以,应用单一分离株不能提供充分的数据信息来鉴定菌种。聚合酶链反应( PCR) 技术PCR又称DNA体外扩增技术。于80年代末期用于分支杆菌菌种鉴定,但鉴定 的菌种主要有结核分支杆菌、结核分支杆菌复合群、副结核分支杆菌与麻风分支 杆菌。只有Portillo等报道的引物仅扩增结核分支杆菌(MTB),是目前已知的 结核分支杆菌最特异的片段。 Patel 等5设计的引物可区别牛分支杆菌和结核分 支杆

5、菌复合群的其他分支杆菌。 Wit 等6设计的引物可区别结核分支杆菌和卡介 苗。Roth等设计的引物因鸟、胞内分支杆菌16-23S rDNA间隔序列相差25个 碱基差异可以将二者区分开。PCR检测分支杆菌有突出的优越性，因而在此基础 上延伸的用于分支杆菌菌种鉴定的各项技术应运而生。四限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析1.16SrRNA 基因序列 PCR- RFLP 分析技术:1993 年 Vaneechoutte 等8用 Cfo、Mbo、Rsa 3种限制性内切酶消化16SrRNA扩增产物，对99株18种不同菌 种的分支杆菌进行鉴定。1996 年 Avaniss、Aghajan 等9用该方法

6、和引物荧光标 记法相结合准确地鉴定了 13种分支杆菌。用 16S rRNA 扩增的 DNA 必须用纯培养 物提取，整个酶切过程仅需8h。由于用单一酶切得到的图谱信息量少，故至少需2 种限制性内切酶消化后才能达到菌种鉴定的目的。2.16SrDNA 和 23SrDNA 间隔序列区 RFLP 分析技术:近年人们发现， 不同菌种 16S23SrDNA间隔序列本身所含的tRNA的数目和类型不同，具有长度和序列上 的多态性，比 16SrDNA 具有更强的高变性，因而可以作为菌种鉴定的一种方法。 1996 年 Lappayawichita 等10用引物 PL1 和 PL2 扩增 113 株 18 种不同菌种

7、的分 支杆菌， 无需酶切即可鉴别快速生长分支杆菌和缓慢生长分支杆菌。用 Hae、Msp、 Bst 消化扩增产物能鉴别结核分支杆菌复合群、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、戈 登分支杆菌、瘰疬分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、蟾蜍分支杆菌等缓慢生长分支杆 菌， 并能鉴别杜氏分支杆菌、母牛分支杆菌、耻垢分支杆菌、龟分支杆菌、草分 支杆菌等快速生长分支杆菌。 1998 年 Sansila 等11用特异性更强的引物 16SC 和23SG扩增380bp片段，经Hae酶切后，结核分支杆菌复合群和鸟分支杆菌、胞 内分支杆菌均产生特征性谱型， 经 Msp 消化后能鉴别胞内分支杆菌和瘰疬分支杆 菌。hsp65基因序列PCR -

8、 RFLP分析技术：1992年Plikaytis等卫报道对存在于所有分支杆菌的65kD热休克蛋白（hsp65）进行扩增，139株19种不同菌种 的分支杆菌均扩增出 1380bp 片段，而19种非分支杆菌未产生此扩增条带。 126 株6种常见的分支杆菌菌种（结核分支杆菌、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内 分支杆菌、堪萨斯分支杆菌和戈登分支杆菌） 扩增产物经 BstN 和 Xho 两种内切 酶消化后除结核分支杆菌、牛分支杆菌外均产生可鉴别的谱型。1997 年Devallosis等报道用PCR扩增分支杆菌65kD热休克蛋白基因的441bp片段， 后经BstE和Hae酶切,34种分支杆菌显示不同的谱型，有

9、些菌种如堪萨斯分支杆 菌、龟分支杆菌、脓肿分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、不产色分支杆菌、微黄分支杆 菌可以鉴定至亚群水平。染色体基因组DNA- RFLP分析技术:该方法对染色体基因组DNA用限制 性内切酶消化， 电泳分析谱型， 可将分支杆菌分成几个大群， 难以将分支杆菌鉴定 到种的水平，而且不同内切酶、不同来源的菌株及不同的染色方法形成的谱型均 不完全相同。其缺点在于， 由于基因组 DNA 限制性内切酶位点众多， 电泳后形成 的条带多， 因而， 结果难以判定， 不适于临床应用。danj基因序列PCR - RFLP分析技术:Take waki等报道danj基因的 PCR 扩增产物内有特异性酶切位点，

10、通过 PCR- RFLP 能快速有效地鉴别结核分支 杆菌复合群与非结核分支杆菌。用 Sma、 Nae、 Hinf、 Fok4 种限制性内切酶能将 19 种非结核分支杆菌分成 10 组， 并能区别鸟分支杆菌与胞内分支杆菌。 danj 基 因同16SrRNA、hsp65和16S- 23SrRNA间隔区序列均不能鉴定结核分支杆菌复合 群内的细菌。利用PCR- RFLP二步法鉴定分支杆菌，能检测DNA核苷酸序列的 微小差异。分支杆菌 DNA 酶切片段有特征性谱型，不仅可用于菌种鉴定，甚至可 以鉴定不同的菌株，在临床诊断及流行病学方面均有重要意义，具有广阔的应用 前景，关键在于引物的设计和限制性内切酶的

11、选择。五、PCR-单链构象多态性（PCR- SSCP）分析技术PCR- SSCP分析技术现已成为广泛应用的一种根据ssDNA构象差别快速灵敏 地检测基因变异的方法。吴雪琼等15建立的 PCR- SSCP 分支杆菌菌种初步鉴定 方法，利用16SrRNA123- 257位核苷酸（按大肠肝菌16SrRNA的编码位置）是原核 生物高变区，通过PCR- SSCP方法分析了 70株结核分支杆菌复合群临床分离株、 31 种分支杆菌标准株和 8 种非分支杆菌标准株, 除结核分支杆菌、牛分支杆菌和 BCG 之间及堪萨斯和胃分支杆菌之间电泳图谱相似外， 其余各种分支杆菌之间电 泳图均有显著差异。该技术操作简便、迅

12、速、经济， 避免同位素的危害， 有可能成 为一种快速有效的分支杆菌菌种初步鉴定方法。DNA-探针杂交技术人工合成寡核苷酸探针:主要用于 PCR 扩增产物的检测。杂交方法常用斑 点杂交法、反向斑点或印迹( dot / blot) 杂交法及微板杂交法等。1993 年 Take waki 等16用斑点杂交法根据分支杆菌特异的 dnaj 基因序列制备了结核、鸟、胞 内、堪萨斯分支杆菌4种32P同位素标记的种特异性寡核苷酸探针，并同16种 分支杆菌 dnaj 基因 PCR 扩增产物进行杂交，能区别结核和非结核杆菌，将重要 的致病性非结核分支杆菌菌种， 鸟、胞内和堪萨斯分支杆菌鉴定至种的水平。1995 年

13、 Kox 等17根据 16SrRNA 高变区序列设计出一系列种特异性探针， 通过反向印迹 杂交试验能将临床标本中分支杆菌鉴定至种。1997 年 Patel 等18建立了 PCR- ELISA(PCR- enzyme-linked immunosorbent assay)微孔板杂交技术，将分支杆菌 16S rDNA 扩增产物在微孔板内与分支杆菌 16SrDNA 种特异性寡核苷酸捕捉探针 杂交， 对分支杆菌进行菌种鉴定， 35 株分支杆菌临床分离株中， 34 株得到正确 鉴定。该方法操作简便， 显色反应类似于 ELISA， 适于临床实验室常规应用。全染色体 DNA 探针:结核分支杆菌全染色体 DN

14、A 具较高的灵敏度 (0. IngDNA)和特异性，与绝大多数分支杆菌不杂交，但与少数DNA同源性高的分支杆 菌如BCG(同源性100%)、牛分支杆菌同源性(100%)、堪萨斯分支杆菌(33%)、胞 内分支杆菌(50%)有较强的交叉杂交， 与鸟分支杆菌( 2%)、胃分支杆菌和龟分支 杆菌也有微弱杂交。此外， 全染色体 DNA 探针与分支杆菌限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术相结合可用于菌株鉴别。Shoemarker等曲利用该方法成功地鉴 定了 15株用限制性内切酶Mbol消化的结核分支杆菌临床分离株DNA。吴雪琼等 20报道结核分支杆菌全染色体DNA探针完全可以鉴别MT和NMT,也可以

15、鉴别结核 分支杆菌和绝大多数结核分支杆菌同源性低的其他分支杆菌， 但对同源性高的少 数分支杆菌无法鉴别。用全染色体 DNA 探针不能直接检测未培养的临床标本 ， 需筛选特异性DNA片段合成寡核苷酸探针，经PCR扩增后方可检出。反转录DNA探针(cDNA探针)：cDNA探针具有种特异性，敏感性高达99%, 特异性为99.2%。目前主要用于液相杂交,鉴定过程只需2h即可完成。cDNA探针 能鉴定的菌种有限，只能检测培养基中的细菌，不能检测临床标本中的细菌，因此 限制了该探针的应用。参考文献:.SoiniH, BotterE C, ViljanenM K. Identification of Myc

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