砖茶中总氟的测定 核磁共振波谱法 编制说明

1、附件3CCAA团体标准草案编制说明基本信息标准草案名称中文砖茶中总氟的测定 核磁共振波谱法英文Determination of total fluorine in brick tea by nuclear magnetic resonance spectroscopy项目类型制定修订（被修订标准名称及编号：） 计划编号2021TB020起止时间2021年12月-2022年12月标准起草单位湖北省食品质量安全监督检验研究院、北京工商大学、北京市食品检验研究院（北京市食品安全监控和风险评估中心）、华中科技大学分析测试中心、武汉大学化学与分子科学院起草组成员江丰、朱松松、范志勇、王会霞、张莉、陈刚、

2、李玮、徐芬、梁平、吴晓军、韩智项目调整情况无背景、目的和意义背景氟是人体重要的微量元素之一，参与人体的许多生命活动，氟的适量摄入有益于人体骨骼和牙齿的钙化，增加骨骼的强度并维持口腔健康，但人体长期生活在高氟环境中，摄入过量氟则会导致全身慢性蓄积性中毒，形成“地氟病”，轻者形成氟斑牙，重者造成氟骨病，严重影响生长发育，危害身体健康。茶树有较强富集氟的能力，叶片是茶树富集氟的主要器官，尽管不同质量、不同产地、不同品牌的茶含氟量均不同，但有大量研究指出，随着茶叶叶龄的增加，叶片中氟含量也逐渐升高，老叶含氟量更是高出嫩叶近十倍。随着近年来消费提档升级，有学者将超微茶粉直接开发成固体饮料，提高茶叶中有效

3、成分的利用率，以满足市场多元化需求，但缺少该类产品中总氟含量的关注，如若生产商使用老叶或劣质茶叶为原料加工生产，必定增加食用人群对于氟的摄入量，对身体健康构成威胁。GB 19965-2005中规定砖茶氟含量限量值为300 mg/kg，2019年全省砖茶氟项目共检测48批次，23批次氟含量超标，不合格率达47.92%。相关文献报道表明，绝大多数砖茶样品检测结果，其含氟量大于300 mg/kg，主要集中在500 800 mg/kg 范围内。随着消费的提档升级和人民群众个性化的饮食需求，各类新型加工工艺的砖茶食品应运而生，因此，有必要对砖茶中总氟的含量进行检测和监控。茶叶中氟的测定前处理方法主要有浸

4、泡法、灰化碱熔法和氧弹燃烧法。现行国标中茶叶氟的测定方法主要是针对水溶性氟，但植物细胞内的氟难以被完全提取，无法准确反映产品中总氟含量；碱熔法在高温下将氟元素全部转化成氟离子，样品损失小，适合茶叶总氟含量测定。定量核磁共振技术(quantitative nuclear magnetic resonance, qNMR)已广泛用于天然产物表征、参考物质质量控制和药物分析中，其中，19F-qNMR具备化学位移范围大、灵敏度高、结构近似的化合物不易出现峰重叠等优势，在定量分析中应用广泛。本研究选择19F-qNMR技术测定茶叶中氟含量，可为茶叶及其制品中总氟的数据监控提供技术支撑。目的 使用定量核磁共

5、振波谱技术实现砖茶中总氟的快速定量测定。意义该标准可为砖茶中总氟的快速定量测定检测提供一种新颖的快速检测方法，具有广泛的适用性。该标准所列方法不需复杂的提取/净化等前处理过程，对大批量、多批次快速定量测定砖茶中总氟的含量提供了一种新的思路。标准主要起草人任务分工湖北省食品质量安全监督检验研究院负责牵头组织，北京工商大学、北京市食品检验研究院（北京市食品安全监控和风险评估中心）、华中科技大学分析测试中心、武汉大学化学与分子科学院、中国认证认可协会等机构分工负责并共同参与起草。主要工作过程标准起草组织工作由湖北省食品质量安全监督检验研究院牵头负责，主要工作为收集整理国内外相关标准和技术资料；制定研

6、究方案、负责分析方法优化建立与验证、样品检验分析；组织标准起草及实验室方法可行性验证，撰写标准文本和编制说明。简要工作进程如下：项目调研2021年11月1日，查阅国内外核磁共振定量检测技术方法和标准，对各方法的原理及特点进行对比分析，确定研究方案，同时进行标准的预研究工作。项目立项2021年11月15日，项目立项。起草阶段2021年11月，各实验小组开展各部分实验工作，定期开展工作总结；2021年12月，对标准建立方法学实验部分汇总，形成标准内容初稿；2022年1月- 8月，各小组对初稿进行评审，对实验数据进行总结补充，对文本就行修改完善，形成标准草案。征求意见阶段2022年9月，标准公开征求

7、意见。标准完善阶段2022年10月-2022年12月。标准编制原则和确定标准主要内容的论据标准编制原则本标准为首次制定，以科学的实验数据为依据，经过科学研究而制定。本标准旨在利用定量核磁共振波谱技术实现砖茶含氟量的快速定量检测。本标准不仅是GB/T 21728-2008砖茶含氟量的检测方法的有效补充，同时对其进行了改进。在简化前处理过程及节约测试时间的同时，保证了测试的准确性与可重复性，能快速测定砖茶中的总氟量，提供了一种新颖快速的检测方法，具有广泛的适用性。同时，本方法在编制过程中引入第三方实验室对本标准所列方法进行验证和评价，具有先进性、科学性、合理性和可操作性。确定标准主要内容的论据本标

8、准拟采用19F-NMR定量检测砖茶中总氟的测定，分别对提取方法等前处理条件、延迟时间(D1) 等仪器条件进行优化，再通过对所建方法进行方法学考察，计算方法的检出限、回收率和精密度，建立定量核磁共振波谱法测定砖茶中总氟的方法，以扩充当前茶叶中氟含量的检测需求。一、前处理方法及仪器条件的确立1、前处理方法的确定茶叶中氟的测定前处理方法主要有浸泡法、强酸溶解提取法、氧弹燃烧法和碱熔法等。浸泡法难以提取植物细胞内的氟，无法准确反映总氟含量；酸溶提取法也难以有效的将氟元素转变成氟离子，从而影响测定结果；氧弹燃烧使茶叶（粉）样品在密闭富氧的条件下反应，操作较为复杂；灰化碱熔法在高温下将氟元素转变成容易检测

9、的氟离子，方便快捷，适合茶叶总氟含量测定。在马弗炉内高温加热，通过碱熔对茶叶样品进行氟离子富集，以5 mL盐酸水溶液洗涤坩埚内壁，用热水将待测试液转移至25 mL容量瓶中定容。空白加标回收率达95%，反应体系快速、稳定。2、金属螯合试剂的选择氟离子作为性质活泼的阴离子之一，易于Ca2+、Fe3+、Mg2+、Al3+等金属阳离子等形成络合物从而影响测定，GB 19965-2005通过添加柠檬酸钠屏蔽金属离子，也有学者通过添加EDTA-2Na络合金属Al元素。研究选取2.50 %柠檬酸钠溶液和1.25% EDTA-2Na溶液作为金属螯合剂，在金属螯合剂添加量为2.0 mL时，信号峰强度稳定（图1）

10、。2.50 %柠檬酸钠溶液和1.25 % EDTA-2Na2.50 %2.50 %柠檬酸钠溶液和1.25 % EDTA-2Na2.50 %柠檬酸钠溶液未添加金属螯合试剂图1 金属螯合剂对信号峰的影响3、特征化学位移的选择用于定量核磁的理想信号峰应与待测样品的定量峰外的其他峰分离良好。本实验参考相关文献，在三氟乙酸为标定物时，目标化学位移为-120 ppm，由于试样经高温碱熔后，氟元素已完全转化成氟化钠，故谱图中无其他价态以及其他氟离子峰出现（图2）。CF3COOHCF3COOH图2 目标物的特征化学位移谱图 4、采集参数的确定一般定量核磁推荐D15T1，本实验采用Bruker标准序列t1irp

11、g，使用标准程序测试了氟标准溶液的T1。依据D1 5T1，将D1设为1 s。其他采集参数为，采样点数TD：65 536，扫描次数NS= 128，采集时间AQ= 0.576 7 s，谱宽SW= 100 ppm，O1P= -120 ppm，O2P= 4.7 ppm，P1= 12 s，增益RG= 203，测定温度298 K。 5、优化后的方法概述a. 主要仪器与设备核磁共振波谱仪（可控温，温度精度不低于 0.1 K；配备5 mm二合一宽带液体探头）；食物粉碎机；电子天平（感量分别为0.000 1 g和0.01 g）；涡旋振荡器（转速 2 000 rpm）；离心机（转速 2 000 rpm）；马弗炉（

12、室温 800 ）;移液器（量程为10 L 100 L和100 L 1 000 L）；坩埚（50 mL，带盖）。b. 金属螯合溶液配制准确称取50.00 g柠檬酸钠和25.00 g乙二胺四乙酸二钠，加水溶解，用水定容至500 mL。c. 测定步骤称取约0.50 g（精确至0.000 1 g）茶叶试样，置于预先加入适量NaOH垫底的坩埚中。将3 g NaOH均匀覆盖于样品表面，加盖后放入马弗炉中逐步升温至600 碱熔消解。消解后，降至室温；取出坩埚，加入5.0 mL盐酸-水溶液洗涤坩埚内壁，并以10.0 mL热水（8095）浸取转移样品至50 mL塑料离心管中，加入2.0 mL金属螯合剂，4 00

13、0 rpm 离心5 min后将上清液转移至25 mL容量瓶中并定容。待测。d. 核磁共振波谱参考条件测定温度：（298 0.1）K；采样点数（TD）：65 536；扫描次数（NS）：128；延迟时间（D1）：1 s；采集时间（AQ）：0.576 7 s；增益（RG）：203；脉冲序列：zgfhigqn.2。e. 试样测定用移液枪精密移取500 L待测液至5 mm标准核磁管中，精密移取100 L重水于核磁管中，将二者混匀，进行上机测试。f. 数据预处理采用线宽因子为10 Hz的窗函数对原始的自由感应衰减信号进行傅里叶变换得到频域谱，然后进行自动相位校正及基线平滑。g. 定性分析如果试样图谱中存在

14、化学位移= -120 ppm（变化范围在 5.0%之内）的物质，则可判定试样中存在该组分。h. 定量峰积分根据定性分析结果，进行定量峰的积分，得到氟离子定量峰积分面积。i. 结果计算试样中总氟含量按式（1）计算 （1）式中： 待测物含量，mg/kg；C 被测样品中氟离子浓度，g/mL；C0 空白试剂中氟离子浓度，g/mL；V 试样最终定容体积，mL；m 称样量，g；f 稀释因子。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后两位。二、方法学考察1、精密度实验随机选取茶叶样品，通过19F-qNMR平行测定总氟含量6次，对目标峰积分, 6次积分面积结果相对偏差为

15、2.50 %，表明使用19F-qNMR测定总氟含量具有较高的精密度。2、回收率实验茶叶样品基质中添加氟含量分别为200 mg/kg、400 mg/kg、2 000 mg/kg三水平的标准溶液，每个水平平行测定3次，计算回收率和相对偏差，结果如表1所示，加标回收率为96.3 % 107.0 %，RSD为4.20 % 6.07 %。表1 回收率实验基质含量mg/kg添加水平mg/kg实测含量mg/kg回收率 / %RSD / %12262001 440107.06.074001 61797.74.202 0003 15396.34.323、检出限以S/N3时确定最低检测浓度，于上述条件下，在 = -70 ppm -170 ppm范围内，本方法F-的检出限为0.1 g/kg。三、实验室间协同试验结果本方法经过华中农业大学理学院、武汉大学化学与分子科学学院、华中科技大学分析测试中心（以下简称为实验室A、实验室B、实验室C）三家实验室进行了方法验证。参与验证单位实验室严格按照标准文本进行检测（表2），对不同水平加标回收进行了测试，验证结果一致。表2 不同实验室间回收率实验对比基质含量mg/kg添加水平mg/kg实验室序号实测含量mg/kg回收率%相对标准偏差，RSD%1 226200A1 450105.07.104001 62097.75.202 0