多聚酶链式反应扩增DNA片段

1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段多聚酶链式反应扩增DNA片段第1页多聚酶链式反应扩增DNA片段第2页课程标准尝试PCR技术基本操作和应用。课标解读1.了解PCR技术基本原理。2.知道PCR技术基本操作过程。3.讨论PCR技术应用。 多聚酶链式反应扩增DNA片段第3页1生物体内DNA分子复制条件(1)四种 是合成子链原料。(2) 提供了DNA复制模板。(3) 打开了DNA双链。(4) 催化合成DNA子链。(5) 使DNA聚合酶能够从 开始连接脱氧核苷酸。PCR技术原理及反应过程 脱氧核苷酸DNA母链解旋酶DNA聚合酶引物引物3端多聚酶链式反应扩增DNA片段第4页2PCR扩增原理及条件(1)概念

2、PCR即 ，是一个 快速 技术。它能以极少许 为模板，在短时间内复制出上百万份 。(2)原理DNA热变性：在 温度范围内，DNA双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为 。当温度迟缓 后，两条彼此分离DNA链又会重新 。子链合成：a.需要 ；b.合成方向总是从子链 端向 端延伸。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNADNA拷贝80100变性降低结合成双链引物53多聚酶链式反应扩增DNA片段第5页(3)条件 模板。分别与模板DNA两条模板链相结合两种 。A、T、G、C四种 。耐热DNA聚合酶，普通用 。需要一定 和能严格控制 温控设备。DNA引物脱氧核苷酸耐高温TaqDNA聚合酶缓冲溶液温度多聚酶

3、链式反应扩增DNA片段第6页3PCR反应过程PCR普通要经历 次循环，每次循环能够分为 、 和 三步。(1) ：当温度上升到 以上时，双链DNA解聚为单链。(2) ：温度下降到 左右， 经过 与两条单链DNA结合。(3) ：温度上升到 左右，溶液中四种脱氧核苷酸在 作用下，依据碱基互补配对标准合成新DNA链。三十多变性复性延伸变性90复性50两种引物碱基互补配对延伸72DNA聚合酶多聚酶链式反应扩增DNA片段第7页思维激活1 DNA复制缘何须须有引物？提醒DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3延伸DNA链，故DNA合成时，必须加入引物(其3游离)以作为延长DNA子链“引子”。多聚酶链式反应

4、扩增DNA片段第8页1细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增比较(见下表)项目DNA复制PCR扩增不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐热TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录、产生引物无转录、需加入两种引物特点边解旋边复制，半保留复制体外快速扩增循环次数受生物体本身控制30屡次缓冲液不需要需要人为控制设备无需要严格控制温度改变温控设备多聚酶链式反应扩增DNA片段第9页相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵照碱基互补配对标准模板DNA为模板引物都需要与模板相结合引物多聚酶链式反应扩增DNA片段第10页2.PCR过程(1)变性当温度上升到90 以上时，双链D

5、NA解聚为单链。(2)复性温度下降到50 左右，两种引物经过碱基互补配对与两条单链DNA结合。多聚酶链式反应扩增DNA片段第11页(3)延伸温度上升到72 左右，溶液中四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶作用下，依据碱基互补配对标准合成新DNA链。多聚酶链式反应扩增DNA片段第12页尤其提醒(1)72 左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸。(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间DNA序列，使该段固定长度序列呈“指数式”扩增。多聚酶链式反应扩增DNA片段第13页【巩固1】 标准PCR过程普通分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要温度依次是(

6、)。A94 、55 、72 B72 、55 、94 C55 、94 、72 D80 、55 、72 解析当温度上升到90 (9096 )以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50 (4060 )左右时，两种引物经过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72 (7075 )时，溶液中四种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶作用下，依据碱基互补配对标准合成新DNA链，称为延伸。答案A多聚酶链式反应扩增DNA片段第14页1试验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控 ，实现DNA扩增。假如没有PCR仪，可用3个 代替，操作时按程序在3个 中 PCR反应微量离心管。(2)微量离心管：总

7、容积为 ，实际上是进行 场所。(3)微量移液器：用于 。PCR技术试验操作及评价 温度恒温水浴锅水浴锅往返转移0.5mL多聚酶链式反应转移PCR配方中液体多聚酶链式反应扩增DNA片段第15页2操作步骤准备 混合 反应。3操作提醒(1)为防止 等原因污染，试验中使用一些用具在使用前必须进行 。(2)所用 和 应分装成小份，并在 储存。(3)在 中添加反应成份时，每吸收一个试剂后，移液器上枪头必须 。加入组分设置PCR循环程序外源DNA高压灭菌缓冲液酶20微量离心管更换多聚酶链式反应扩增DNA片段第16页思维激活2 PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋转酶吗？提醒PCR操作中，模板DNA仍需解

8、旋，但该解旋过程不是DNA解旋酶催化结果，而是利用DNA热变性原理，在80100 温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此到达解旋目标。多聚酶链式反应扩增DNA片段第17页1PCR仪：PCR自动化程度较高，参考下表设计程序即可。循环数变性复性延伸第1次94 ，10 min30次94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min最终一次94 ，1 min55 ，30 s72 ，1 min 多聚酶链式反应扩增DNA片段第18页(将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。目是使反应液集中在离心管底部) 多聚酶链式反应扩增DNA片段第19页多聚酶链式反应扩增DNA片段第20页3试验中DNA含

9、量测定DNA在260 nm紫外线波段有一强烈吸收峰，峰值大小与DNA含量相关。能够利用DNA这一特点进行DNA含量测定，详细方法以下：稀释：2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计读数调整至零多聚酶链式反应扩增DNA片段第21页测定：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260 nm处光吸收值计算：DNA含量(g)50(260 nm读数)稀释倍数尤其提醒若没有PCR仪，可进行水浴扩增DNA设置3个恒温水浴锅，温度分别为94 、55 和72 ，在3个水浴锅中依据PCR仪处理时间往返转移PCR反应微量离心管即可

10、。多聚酶链式反应扩增DNA片段第22页【巩固2】 聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段一个方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目标DNA得以快速扩增，其简明过程如图所表示。以下关于PCR技术叙述不正确是()。APCR技术是在试验室中以少许DNA制备大量DNA技术B反应中新合成DNA又能够作为下一轮反应模板CPCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增D应用PCR技术与探针杂交技术能够检测基因突变多聚酶链式反应扩增DNA片段第23页解析PCR技术是人工合成DNA方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。答案C多聚酶链式反应扩增DNA片段第2

11、4页【例1】 (江苏)请回答相关问题。(1)利用PCR技术扩增目标基因，其原理与细胞内DNA复制类似(以下列图所表示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸基础。PCR技术原理 多聚酶链式反应扩增DNA片段第25页从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物ADNA片段所占百分比为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(以下列图)，请分别说明理由。多聚酶链式反应扩增DNA片段第26页第1组：_；第2组：_。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面表示式不能正确反应DNA聚

12、合酶功效，这是因为_。多聚酶链式反应扩增DNA片段第27页思维导图：多聚酶链式反应扩增DNA片段第28页多聚酶链式反应扩增DNA片段第29页多聚酶链式反应扩增DNA片段第30页归纳提升PCR技术特点：(1)PCR不需要解旋酶，而生物体内DNA复制时需要解旋酶；(2)PCR需要耐热DNA聚合酶，而生物体内DNA聚合酶在高温时会变性；(3)PCR普通需经三十屡次循环，而生物体内DNA复制需要生物体本身控制。多聚酶链式反应扩增DNA片段第31页【例2】 使用PCR仪详细试验操作次序应为()。设计好PCR仪循环程序按配方准备好各组分用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A BC D思维导图：PCR技术试验操作及注意事项 多聚酶链式反应扩增DNA片段第32页深度剖析PCR反应操作步骤普通分为准备(包含配制配方及将各配方放于试验台上)移液混合离心反应。因PCR仪是一个自动控制温度仪器，设计好循环程序就能够进行反应了。答案C多聚酶链式反应扩增DNA片段第33页单击此处进入 随堂达标检测多聚酶链式反应扩增DNA片段第34页教材P631提醒绘图可参考教科书中图59。PCR反应中DNA片段普通以2n方式积累，其中n为反