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文档简介

1、CaCl2法制备大肠杆菌感受态转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地 遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaC12 ,RbCl(KCl)等化学试剂 法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进 入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现 遗传

2、信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培 养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感 受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实 验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70C 保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。材料E. coli DH5a 菌株:R_,M_,Amp_;pBS 质粒 DNA:购买或实验室自制，eppendorf 管。试剂1.LB 固体和液

3、体培养基：配方见第一章。2.Amp 母液：配方见第一章。3含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C左右， 加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4麦康凯培养基（Maconkey Agar）:取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml,微火煮沸至 完全溶解，高压灭菌，待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后 摇匀后涂板。5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水中,定容至 100 ml,高压灭菌。6含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2

4、（无水，分析纯），溶于50ml重蒸水 中，加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。三、操作步骤受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中,37C 下振荡培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接 种于100ml LB液体培养基中,37C振荡培养2-3小时至OD600 =0.5左右。感受态细胞的制备 （ CaCl2 法）1）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟,然后于4C下3000g离心10分钟。2）弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaC12溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 分钟后,4C下3000g离心10分钟。3）弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的

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