死亡受体5诱导Jurkat细胞凋亡的作用

1、死亡受体5诱导Jurkat细胞凋亡的作用【关键词】细胞凋亡RlefDR5inTRAILinduedapptsisfJurkatells【Abstrat】AI:TstudytherlefDR5inTRAILappttisignaltransdutininJurkatells.ETHDS:DNAntainingfulllengthextraellulardainfhuanDR5aslnedintpGAPZ.RebinantPihiapastrislnegeneratedviahlgusrebinatinseretedhighlevelsfsDR5.BALB/ieereiunizedithsDR5i

2、nFAtprepareantiDR5Ab.ThebindingfantiDR5AbaseasuredfrsurfaeexpressinfTRAILreeptrbyflytetrianalysis.JurkatellseretestedfrthEirsuseptibilitytapptsisinduedbyTRAILithTRAILapptsiskitsaststudytherrelatinbeteenDR5expressinlevelandTRAILsensitivity.ThelevelfDR5expressinnJurkatelllineasexainedbyflytetry.Therat

3、esfTRAILinduedapptsisandantiDR5AbblkingnJurkatellseretestedbyflytetryithTRAILapptsiskit.RESULTS:ThekillingrlefTRAILasblkedinJurkatellspretreatedithantiDR5Ab.Theaverageperentagefblkingas90.49%.NLUSIN:AntiDR5AbanspeifiallybindtDR5andDR5isexpressedathighlevelsnJurkatells.DR5playsaverykeyrleinTRAILindue

4、dapptsisinJurkatells.DR5expressinisiprtantfrtheindutinfapptsisbyTRAIL.【Keyrds】Jurkatells;TRAIL;apptsis;DR5;antibdies,nlnal【摘要】目的：讨论DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用.方法：用含人全长DR5细胞外全长构造域重组DR5免疫BALB/小鼠，制备抗DR5Ab.将96孔U型细胞培养板加1105/孔Jurkat细胞和5g/L抗DR5Ab，采用TRAIL试剂盒检测细胞凋亡率.结果：抗DR5Ab与Jurkat细胞外表的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀

5、伤功能几乎被抗DR5Ab完全阻断，阻断率高达90.49%.结论：DR5在TRAL诱导的Jurkat细胞凋亡中起关键作用.【关键词】Jurkat细胞；TRAIL；细胞凋亡；DR5；抗体，单克隆0引言肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体turnersisfatrrelatedapptsisinduingligand,TRAIL是近几年新发现的TNF超家族成员，TRAIL与其受体结合可以诱导大多数肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响.已经发现，TRAIL有5种受体，即2种死亡受体DR4,DR5、2种诱骗受体DR1,DR2及可溶性受体PG(steprtegerin).其中只有DR41和或DR5有胞内死亡构造域

6、，诱导细胞凋亡.DR4和DR5在诱导细胞凋亡方面具有一样的作用，但哪一种受体在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡方面更为重要仍不清楚.开展和应用TRAIL不同受体的特异性抗体是分析这两种不同受体所参与的死亡途径的关键.我们用特异性抗DR5Ab阻断DR5的功能，并应用流式细胞仪检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡情况，以讨论DR5在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡中的作用.1材料和方法1.1材料含有人DR5细胞外构造域全长DNA的毕赤酵母表达载体菌株由美国宾夕法尼亚大学医学院病理医学实验室陈有海教授馈赠.Jurkat细胞为本室保存细胞株传代培养于含2.0l/LL谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、10.0l/L

7、HEPES,1.0l/L丙酮酸钠、100.0L/LFBS,1105U/L青霉素和100g/L链霉素的RPI1640培养基.DE/HAT和DE/HT选择培养基Siga公司.TRAIL凋亡检测试剂盒Upstatebiteh.FASalibur型流式细胞仪美国BD公司.1.2方法1.2.1抗DR5Ab制备及特异性鉴定1.2.1.1抗DR5Ab制备参照文献2制备抗DR5Ab.抗DR5Ab类型经ELISA法测定Ab的类型分别为IgG1(Y366,Y369)和Ig(Y362,Y363,Y367)，两者均可与sDR5结合，经流式细胞仪分析发现仅IgG能与Jurkat细胞外表的DR5结合.1.2.1.2流式细

8、胞仪分析Ab与胞膜DR5结合取生长状态良好的Jurkat细胞，用含50g/LBSA的PBS洗涤3次，计数细胞，取1105细胞与杂交瘤细胞培养上清100L混合，冰浴反响30in.预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1LFIT标记的山羊抗小鼠IgG或IgJaksnIunResearh，冰浴30in.预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进展分析FASan,BetnDikinsn.1.2.1.3sDR5对Ab膜结合的阻断作用将10LsDR5(178g/L)与100L杂交瘤培养上清室温反响30in，然后与1105Jurkat细胞混合，冰浴反响30in.预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1LFIT标记的山羊抗

9、小鼠IgG，冰浴30in.预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进展分析.1.2.2细胞外表DR5表达程度检测将生长状态良好的Jurkat细胞用含50g/LBSAPBS洗涤3次，计数细胞，取密度为1108/L的细胞100L，加抗DR5Ab1g，冰浴反响30in.预冷PBS洗涤细胞3次，加PBS100L和FIT标记的羊抗小鼠IgG1L混合，置冰浴30in.PBS洗涤3次后用流式细胞仪进展分析.1.2.3TRAIL诱导细胞凋亡率的检测TRAIL凋亡检测试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率，50L培养基加至96孔U型细胞培养板，第1孔加50LTRAIL,终浓度为100g/L，并做倍比稀释.每孔加50L小鼠抗

10、TRAILAbIgG1至终浓度为1.5g/L,加待测细胞悬液100L,细胞终浓度为1109/L.37,50L/L2培养12h,PBS洗涤3次，每管加PBS100L,PI10L,流式细胞仪检测细胞凋亡率.1.2.4DR5Ab对TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡的阻断效应将96孔U型细胞培养板加1105/孔Jurkat细胞及5g/L抗DR5Ab，室温反响30in,按1.2.3方法检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡率.2结果2.1DR5Ab与胞膜外表DR5结合特异性检测2.1.1DR5Ab与胞膜外表DR5结合率经ELISA分析交融出的5株杂交瘤细胞所有产生的抗DR5Ab均能与sDR5结合，Ab类

11、型影响与胞膜受体的结合，只有抗DR5IgG类抗体(Y366,Y369)可以结合至Jurkat细胞外表Fig1.Ig类抗体(Y362,Y363,Y367)无法与细胞膜结合.6A5是不产生DR5Ab杂交瘤培养上清.2.1.2sDR5对Ab阻断作用在无sDR5条件下Y366Ab的ELISAA450n值为1.76,用2.5,5.0,7.5,10.0gsDR5中和抗DR5Ab,A450n值分别为1.25,0.25,0.22,0.15,随着sDR5浓度的增加对Y366的中和作用增强，在高剂量时可以完全阻断Ab的作用，说明Y366与DR5特异性结合.2.1.3sDR5对DR5Ab膜结合阻断结果sDR5可以完

12、全阻断DR5与Jurkat细胞膜的结合Fig2.说明抗DR5Ab与细胞膜DR5的结合是特异性的.实心曲线代表Ab与DR的结合，空心曲线代表sDR5的阻断作用.2.2DR5在Jurkat细胞外表表达DR5在Jurkat细胞外表的表达率为94.83%,证明DR5在Jurkat细胞外表的高程度表达Fig3.2.3TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡及抗DR5Ab的阻断作用TRAIL及抗TRAILAb结合应用可以诱导其敏感细胞株Jurkat细胞的凋亡，并呈现明显的剂量相关性.TRAIL浓度在50100g/L时对Jurkat细胞的凋亡率达90%以上.预先用抗DR5Ab与Jurkat细胞外表的DR5作用后，

13、TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被Ab所阻断，其平均阻断率达90.49%Fig4.3讨论目前，TRAIL与TRAIL受体抗肿瘤的信号传递过程及调节以及正常细胞对TRAIL抗性机制尚未完全清楚3.TRAIL可以与两种不同的膜结合受体DR4,DR5、两种诱骗受体DR1,DR2及可溶性受体PG相结合1.DR4和DR5均含有传导TRAIL凋亡信号所需要的胞内死亡构造域(deathdain,DD)，与TRAIL结合可以引起细胞凋亡，DR1和DR2的膜外区有两个与DR4和DR5高度同源的富含半胱氨酸的伪重复序列，可以与TRAIL结合，但DR1没有胞内DD，DR2的胞内区那么仅有一段不完好的D

14、D，因此二者都不能传递TRAIL的死亡信号4,5.虽然DR4和DR5在4与TRAIL具有相似的结合力，但在37DR5与TRAIL的亲和力最强6.最近发现因各种因素如IFN及许多化疗药物增加细胞对TRAIL凋亡的敏感性也是通过进步DR5的表达实现7-9，上述结果说明,DR5在TRAIL诱导细胞凋亡方面非常重要，但并不能完全排除DR4的作用，区别DR4和DR5在介导TRAIL凋亡中的作用及功能比重，对理解TRAIL的抗肿瘤机制、调控及TRAIL的临床应用均非常必要.在过去的报道中，对DR5的研究主要采用RNA程度的检测，而RNA的表达不能完全反映蛋白质的表达程度，对DR5细胞质和细胞膜表达情况也缺

15、乏理解，只有表达于胞膜的DR5才能介导TRAIL凋亡功能.为了讨论DR5表达与细胞对TRAIL敏感性的关系及进一步讨论TRAIL的功能，我们通过基因工程技术获得DR5高表达工程菌，用sDR5免疫BLAB/小鼠，交融、挑选出5株抗DR5杂交瘤细胞.制备2种能与sDR5和胞膜DR5结合并具有封闭TRAIL凋亡的Ab.用ELISA方法检测发现，抗DR5Ig和IgG类Ab均可以与sDR5结合，但用流式细胞仪分析发现仅IgG类Ab能与细胞膜外表的DR5结合.为确认抗体的特异性，采用ELISA和流式细胞分析发现，sDR5可以阻断抗DR5Ab与包被到ELISA反响板上的sDR5及Jurkat细胞结合，说明制

16、备的Ab是DR5特异性，而且IgG类Ab是与胞膜外表DR5表位相结合.为检测不同浓度sDR5对抗DR5Ab结合Jurkat细胞的抑制效应，我们将Y366与sDR5混合30in，然后检测其结合受体的比率.最低浓度的sDR5仍能抑制Y366结合Jurkat细胞DR5.在挑选出的2株Y366和Y369Ab中Y366的结合才能强.竞争实验发现Y366可以有效地与TRAIL竞争性地与DR5结合，从而阻断TRAIL的凋亡作用，说明Y366可以识别TRAIL与DR5结合的表位.用Y366分析发现DR5在Jurkat细胞外表表达为94.83%.虽然有关TRAIL每一种受体生物学功能及结合时所产生的信号仍不非常

17、清楚，但在此研制的DR5Ab为受体的研究提供一种非常有价值的工具.因此，我们制备出可以与DR5特异性结合的Ab,并在TRAIL敏感细胞株Jurkat外表直接检测到DR5的高程度表达.我们采用TRAIL与抗TRAILAb交联诱导Jurkat细胞的凋亡，并呈现明显的剂量相关性,TRAIL浓度在50100g/L时对Jurkat细胞的杀伤率达90%以上.预先用抗DR5Ab与Jurkat作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被Ab所阻断,其平均阻断率达90.49%.结果说明，DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中起着非常关键的作用，并占有绝对的功能比.由于增加TRAIL的浓度并不能

18、进步Jurkat细胞的凋亡率，说明在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡方面DR4没有发挥作用.结果也说明，该Ab是一种有效的DR5阻断抗体，可以和DR5特异性结合，对研究TRAIL的作用机制及调控将会非常有价值.【参考文献】1PanG,NiJ,EiYF,etal.AnantignistdeyreeptranddeathdainntainingreeptrfrTRAILJ.Siene,1997;277(5327):815-818.2马远方，杨东亮，陈有海.抗DR5单克隆抗体在分析TRAIL受体表达中的应用J.中华医学杂志，2022;116(6):947-950.aYF,YangDL,henYH.

19、AnalysisfTRAILreeptrexpressinusinganvelantiTRAILdeathreeptr5nlnalantibdiesJ.hinedJ,2022;1166:947-950.3JangYJ,ParkKS,hangHY,etal.AnalysisfthephentypesfJurkatlnesithdifferentTRAILsensitivitiesJ.anerLett,2022；1941:107-117.4PanG,NiJ,YuG,etal.TRUNDD,aneeberftheTRAILreeptrfailythatantagnizesTRAILsignallingJ.FEBSLett,1998;4241:41-45.5Ha,BeguintF,ndrelliG,etal.Indutinandintra