兽药大鼠传统致畸试验指导原则

1、兽药大鼠传统致畸试验指导原则一、概述<-）定义与目的传统致畸试验是通过观察药物对母体子宫内的胚胎或胎儿产生的薛作用.包括外观、内脏和骨 骼陶形.对药物的胚胎毎性进行评价的一种方法.母体在孕期受到可通过胎盘屏障的菜种有宮物质 作用，彩响胚胎的器官分化与发育，导致結构和机能的缺陷，出现胎儿腐形.因此.在受孕动物的 胖胎瑞床后.并已开始进入细胞及器官分化期时给予受试药物，可检出受试药物对胎儿的致崎作用"为了确保大鼠致购试验结果的兵实性、可靠性和可追潮性，根据新药研究的规律，结合国内 轉药竈理学评价的实际情况制定了本指导原則.（二）适用范围本规程适用于兽用化学药品、中善药、消那剂及饲料

2、药物添加刑的大段致鮒作用测定.二、试鲨设计（-）材料与方法1. 实验动物选择spf级健廉性成熟（90lood）大风.未交配过的靑年雌取8090只，俺就减半.2. 药品和试剂（1）受试物（2）阳性对照物可选用敌枯双nn 甲撑双（2氨基-134囉二哇）.matda）,要求分析纯以上，含厦不低于 98j%给药剂董为0.51.0mg/kg体重.经口给予.另外阳性对照物还可选用五氯酚钠（30mg/kg体重）、阿斯匹林（250300mg/kg体乘）及維生 素a （7513mg/kg体霾）等.（3）试刊：甲莊、冰乙战、2. 4, 6三硝基粉、氢氧化钾、甘油、水合氯醉、茜泰红（4）其他试液茜素红上备液冰乙5.

3、0ml,甘油lo.oml. 1%水合篡醛60.0ml配成混合液，取适量茜我红边加边復拌，直 至饱和为止.置榇色瓶中保存.齿素红应用液取曲素红贮备液iml,加1%氢氧化钾溶液稀释至loooml,置棕色瓶中临用时配制透明液a甘油20ml2%氢氧化钾溶液3ml,加蒸憎水至100ml混合.透明液b甘油50ml, 2%氢氧化钾溶液3ml,加蒸ts水至100ml混合.固定液（boui血液）2.4,6-三硝基酚（苦味酸饱和液75份、甲醛20份、冰乙酸5份混合.3. 仪器设备生物显微镜及体视显微镜游标卡尺（百分尺实脸空梵它常用设备（二）试验步骤1. 剂组设计役3-5个试验组.另外设一个阴性（溶剂）对照姐和一个

4、阳性对照组.试验组高剂量原测上应 便部分孕斂（和/或胎效）出现毒性作用，如体重域轻帛 低剂星不应引起基性作用，各组可采用1/4、 1/16、1 / wldw等剂jt急性毒性试验给予动物受试药物量大剂量（量大使用浓度和最大淞胃容量） 无死亡时.以30天唱养试验的绘大未观察到有害作月剂量为高剂fit以下设24个剂5l毎组至少 保证】2只孕肌2. 受孕臥检責性成熟雌、挂大取按1:1 （或2:1）同宠后，母日早晨观察阴栓（或阴道涂片），以査出阴栓（或 从阴道涂片中观察到梢子）确认雌啟己交配，将该堆竄作为试验用就，并以当日作为“受孕"零天连续将雌、雄大帆进行同笼交配.反复检査雌亂的受精情况，宜

5、到检岀的“受巒6t数足以进厅 试验，如集5天内筠未交配，则更换堆孔动物交配以空温20-25x?为宜.环墳应安孰必耍时蚁 以麦芽、蛋桂等营养物质。3. 试验动物称重、标记编号和分组不斷将同一天检杳确认的“受穩亂”进厅称重、标记編号，采用完全随机法分组直到各组“受粘 歐'达12只以上.4. 致突变阳性对照物及受试药物溶液配制（1）阳性对照物z确龙阳性对照物种类及其给于刑量（參见“（一）2. （1） ”）按0.51.0ml/100g体貳给予大鼠 受试药物灌胃容童，计算阳性对照物溶液帝配制的浓度.拟定需配制的体枳，计算配制溶液时需称 取阳性刈照物的量.（2）受试药物配制根据受试药物理化性质，选

6、定港剂，将受试药物配制成水溶淞（或乳化剂、浪悬液、糊状软等） 必要时加入增涪剂或助悬剂（如吐隘80、淀粉、竣甲基纤维素钠等）各剂量组受试药物溶液可采用倍比稀释法配制根据设计的受试药物刑园，按大取灌胃容it耍 求，确定高剂量徂（即第i剂n组）受试药物溶液希配制的浓度以及各剂楚组所需受试药物溶液体积， 再拟定第1剂尼组受试药物初始溶液希配制的体积，计算雋称取/豪取受试药物的风5. 给药方案采用经口港胃给药.从受孕的第7天第16天，1次/d,连续10d分别在受孕的第0日、第7日、第12日、第16日及第20日对孕鼠进行称重，按大鼠潅胃容址耍求， 调整各时段受试药物涪液酒胃盘。6. 临床观察在试验期问险

7、査记录妊娠大貳的摄食、饮水及第玄情况观察妊娠大fit的一般行为衰现、中潯 及死亡情况.7. 孕取的处死及检査于奸嫌笫20天称取孕肌体更断头处死孕鼠，剖股取出卵巢、子言，检査黄体数、吸收胎数、 死胎数、活胎数，活胎取雌雄比，胎載在子宫内位置，称取卵與貳、子宫连胎k血（包括羊水）、子宫政等.&活胎載检査测活胎鼠的休:.体长.更长.检连活胎凯外观喊形.胎亂体农检査项目见表19.胎骨标本制作与检查（1）胎骨标本制作将毎寰一半的活胎放入95%乙醉屮固定23周.取出胎歐流水冲洗数分钟后放入2经氢氣化钾 洛液内（至少5倍于胎載体积）透明872h,然后放入凸素红应用液中染色648h,并轻摇12次/山直

8、至头骨染红再取出胎k.放入透明液a中12d.放入透明液b中23d.待雪骼红染而牧 组织基本镯色即可.表1致畸试验活胎61体表检査项目头部躯干部四肢无脑症脚骨裂多肢脑膨出陶林裂头盖裂脊椎裂短肢脑枳水脊椎侵1弯半肢小头症脊推后弯多捋颜面裂脐疝无指小眼症床遭下裂并指眼球突出无肛门短指无耳症砸尾、卷尾 >小耳症无尾耳低位腔裂无穎症小頻症下频裂口唇裂（2）胎骨标本检査：将胎仔标本取出放入小平u1中.用透射光源，在体视显做镜下作療体观蔡，然后逐步检査骨昭 （见茨2测头顶间什及后头卄缺损悄况，於后检春腸骨的数目、缺失或融合（胸什为6个.# 化不充全时片先缺第5厲骨、次快;r 2膺骨儿检直助骨（肋肯適常

9、为1213对，常见崎形有融合助、 分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断尊），检査弁柱发耳和椎体数目（颈椎7个，胸椎12 13个，3?椎56个，詆椎4个，庫椎35个）以及椎骨询无愍合、纵裂等.最后检査四肢常农2致崎试验胎mji骼检査项目枕骨借化中心.发育不全数目、黴合、纵裂、冊分裂开、骨化中心数、发耳不全、缩窄、脱离、形状弓克目、骨化中心数、形状异常、融合、裂开、缩窄、脱离四肢骨形状、数目魂骨件化中心敷拿骨形状tt#形状肋骨数目.形状、融合、分叉.缺损、发育不全w# 形状、完全缺损、胸骨节融合、裂开、形状异常、发育不全10胎服头£、内脏检査禅每寞的另一半胎队放入buins液中.固

10、定两周后作内虹险査（见丧3）先用自來水冲上固定 没，将缺仰放在石蜡板上，剪去四肢和崑，用刀片从头部到尾部逐段檄切或纵切.按观察不同部位 新面器官的大小.形状和相对位賈.正常切面见下图.经口从舌与两口角向枕部横切（切面1，可观蔡大脑、间脑、正脑、舌及發裂在眼浒血作垂 直纵切（切面2）、可观瑕鼻部.从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面3）和沿头部聂大横位处穿 过脑作切面（切面4）,该两切面可观察舌裂、双义舌、额裂、眼球歸形、鼻諭形、脑和裁室异常 沿下顎水平通过颈部中部作横切面（切面5九可观察气讶、禽讶和延脑诙脊19然后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检玄心、肺、橫諏、肝、胃、肠等脏器的大小、位置，检 査左

11、半将其摘除，再检査肾脏、输尿耸、膀胱、亍宫或窣丸位置及发育情况.燃后将疔脏切开，观 察有无肾盂枳水与扩大.聂3致畸试验胎馭内脏检査项目mt（w«）sb凌郁眼球发宵不全侧脑室扩张第三筋室扩张无脑症无眼球底小bs球症角膜缺损右位心房中陽w拐主动脉弓伏道闭惯无肺症多和箜帅叶融令m疝气内狂妊异位肝分叶斤常 肾上腿缺夫多马失失失位失不 缺尿w畀統ff k丸ak宫发 勝睪卵卵子宫号积水肾轶失输卵管枳水（三）试验結果整理及敷据分析1. 受试药物对妊娠大駅的一般行为表现、中壽及死亡情况的影响2. 受试药物对妊娠大鼠摄食、伙水及增轉的响3受试药物对大取生殖机能的影响异常心胱异常肺脏异常肝异常腎、踊胱异

12、 常生建器育异 常其它内腑畸形平 均数内脏畸形平均數=内脏畴形总数曲査胎区数）7 数据分析各种率的统计用疋检验.孕凰增直用力建分析或屮:魯数统计，胎限身长、体乘、平均活胎數、 子音连胎重割用t检验.結果能得出受试药物是否有母体壽性和胚胎得性、致崎性，最好能得出最 小致越剂量为比较不同有害物质的致鬧强度，可计算致酹指数：致畸指数二*im.ld50最小或畸剂債(1)，为衰示有害物质在伙品中存在时人体受害几率.可计算致酚危害指数:致崎危皆抬松:茫最大可能摄入董（四）结果评价判定标准：致腐指数v10为不致畸；10s致畸指数0100为致畸：致畸指致a100为强致畸致崎危害指数300表明受试药物对人危害小；1005致畸危害指数s300表明受试药物对人危害中等；致畸危害指数v100表明受试药物对人危害大（五）注就事项1除特别注明外.试验用水为蒸熠水，试剂为分析纯试剂，动物为spf实验动物2. 实脸动物饲养环境要求达到spf级.3. 有的吸收胎仅有若床腺附着于子宫系膜上，呈黄白色小结节状，观察时要认丸辨认4打开肠腹腔检査伪脏时.耍避免刀片切入过深或剥离过竄的情况以免适成脏弱移位的损伤.5. 当试脸组大亂的受孕率较对照组明显为低时，应考总至受试药物引起胚胎早期死亡、流产、 机化的可能性.三、试验报吿为公正、科学地评价药物的待殊焉性，对试验报吿内容做如下耍