标记HRP——简易过碘酸钠法学习资料

1、标 记 HRP 简 易 过碘酸钠法标记HR简易过碘酸钠法1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的a -和&氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wils on等改用在低PH下使NalO 4氧化HRP从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP步骤。HRP经NalO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBHi (或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体试剂及器材0.1M NalO4：称取241mg高碘酸钠溶于10ml蒸馏水中。1mM PH4.4醋酸钠缓冲液：0.2M NaAc (1.361 克/ 50ml)3.7ml0.2M HAc (0.601ml /

2、 50ml)6.3ml加蒸馏水至2,000ml。0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液：Na2 CO30.32 克NaHCO 0.586 克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。NaBHi 溶液(4mg/ ml):临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。0.15MPH7.4 PBS(6)饱和硫酸铵操作步骤(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO 4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4C过夜。 力口 20卩1 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使

3、以上醛化程RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mg lgG(抗体，或SPA5mg在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅 拌2小时。力口 0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置 4C 2小时。将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4C过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 C 1小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4 的 PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除

4、沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻 保存。结果判定定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mg/ ml) = OD403nm 0.4IgG 量(mg/ ml) = (OD280nmQD403nm 0.3) x 0.62酶量(mg/ ml)IgG 量(mg/ml)酶量克分子比值= 十 =X 440,000160,000IgG 量操作步骤称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。向溶液中加入 0.5ml新配的0.1M NaIO4溶液，混匀，4C静置30分钟。 加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。 加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9

5、.5 碳酸盐缓冲液透析，4C过 夜。 力口 0.2 mL 新配的 5 mg/mL NaBH4 液，混匀，再置 4 C, 2h。(6 )在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 C 1h。 3000 r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15moL/LpH7.4 的 PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15 moL/L pH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000 r/min 离心30 min去除沉淀，上清液即为酶结合 物，分装后，冰冻保存。注意事项(1 )为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中的抗体含量。(2)碘酸钠

6、要新鲜配制。操作步骤取HRP 5mg溶于0.2mol/L , pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNF无水乙醇溶液 0.1ml，室温下轻微搅拌 1h;加入新鲜配置的0.1mol/L NalO4 0.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，置4C放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色； 加入2.5%乙二醇1ml,室温下轻微搅拌1h,终止反应；(4)加入待标记的抗体 5-10mg, 用1.0mol/L ,pH9.5 CBS调节pH值至9.0 ;混匀，置4 C过夜加入硼氢化钠溶液 0.1ml，混匀，4 C放置3h ;对 0.01mol/L , pH7.4 PBS 4C透析过夜，换液 3 次；3

7、000r/min离心30min，去除沉淀物；收集上清液即为酶标记抗体。【注意事项】在氧化HRP时，以pH5.6醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。一般认为氧化 HRP 5mg NaIO4量以0.06mol/L0.5ml为宜，不能低于0.015mol/L0.5ml。（3） 氧化HRP时间以15-30min为宜。 加入DNFB勺目的是为了封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。加入乙二醇的目的是终止反应；为便于在加入抗体后调pH值，故乙二醇要用0.05mol/LCBS 配制。改良过碘酸钠法：取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/LNalO4水溶液（10ml双馏水+ 128mg NaIO

8、4） 0.5ml，混匀，置 4 C 30min ;取出后加入 0.16Mol/L 乙二醇水溶液（10mlH2O+0.09ml乙二醇）0.5ml，室温放置30min :加入含5mg纯化抗体的水溶液 1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h（或过夜），使之结合；加入 NaBH4溶液（5mg/ml）0.2ml，混匀，置 4 C 2h;在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4C 30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02MOI/LpH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4 C透析除盐过夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶抗体（HRP IgG）结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;效价测定合