全套课件·酶工程

1、酶 工 程第一章 绪论第一节 酶的基本概念与发展史 一、酶是一种生物催化剂 酶是一种由活细胞产生的具有生物催化功能的生物大分子。现在，已知的酶都是由生物体合成的，除少数具有催化能力的RNA外，其化学本质都是蛋白质。它们大部分存在于细胞体内，少部分分泌到体外。 一切生命活动都是由新陈代谢的正常运转来维持的，新陈代谢是生命活动的最重要的特征之一。而酶则是促进生物体内一切代谢活动的物质，没有酶的作用代谢反应就无法进行，生命也即停止。酶在生物体内发生的作用主要有以下几种类型：第一节 酶的基本概念与发展史 （1）催化代谢反应，建立各种各样代谢途径和代谢体系； （2）执行具体的生理机能，如乙酰胆碱酯酶能水

2、解乙酰胆 碱，参与神经传导； （3）协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换、传递和放大作用，调节生理过程和生命活动，如腺苷酸环化酶对糖类代谢的调节； （4）清除有害物质，起着保卫作用，如超氧歧化酶能破坏超氧负离子，从而防止脂质超氧化。 第二节 酶催化作用的特点 一、高效性 因为酶催化时所需活化能很低，催化效率远比非酶催化剂高。但由于非酶催化的反应速度太低，不容易观察，酶催化反应速度和在相同pH及温度条件下非酶催化反应速度可直接比较的例子很少。在可比较的情况下，酶的催化效率比非酶催化剂的催化效率高1071013倍。例如过氧化氢（H2O2）在铁离子或过氧化氢酶的催化作用下均能发生分解反应生成氧和

3、水，反应式如下： 催化剂 2H2O2=2H2O + O2 在一定条件下，1mol铁离子可催化105mol过氧化氢分解；相同条件下，1mol过氧化氢酶则可催化105mol过氧化氢分解，过氧化氢酶的催化效率是铁离子的1010倍。 第二节 酶催化作用的特点 二、专一性 酶的专一性是指在一定的条件下一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。这是酶最重要的特性之一，也是酶与其他非酶催化剂最主要的不同之处。酶催化的高度专一性是酶在各个领域广泛应用的重要基础。不同的酶其专一性有所不同，主要表现为以下三种情况： 第二节 酶催化作用的特点 (1) 很多酶只能催化一种底物进行一种快速反应，这种

4、高度的专一性称为绝对专一性。如脲酶只能催化尿素的反应，或者以很低的速度催化结构相似的类似物。 (2) 有些酶能催化一类底物起反应，特异性较低，人们称之为相对专一性。如蔗糖酶既能催化水解蔗糖，也能催化水解棉子糖，因为它们有相同的化学键。 (3) 还有些酶能催化底物的立体异构体之一起反应，表现为高度的立体特异性，被称为立体异构专一性。有人也把这种情况归为绝对专一性中。如乳酸脱氢酶只催化L(+)-乳酸脱氢，不能催化D()-乳酸脱氢。第二节 酶催化作用的特点 三、反应条件温和 反应条件温和是酶催化作用和非酶催化作用之间的另一个显著差别。酶催化作用一般都可在常温、常压、近乎中性的pH条件下进行，而一般非

5、酶催化剂的催化作用则大多需要高温、高压和极端的pH条件下才能进行。如用酸水解淀粉生产葡萄糖，需要2.53kg/cm2压力、140150和耐酸设备；而用酶水解淀粉， 在65下，用一般设备即可。这为简化设备、降低成本和改善劳动强度创造了条件。 第二节 酶催化作用的特点 四、酶的活性是受调节控制的 酶对反应条件极为敏感，其活性是受调节控制的。酶活性的调控方式很多，主要包括酶浓度调节、共价修饰调节、激素调节、抑制剂调节、反馈调节以及金属离子和其他小分子化合物调节等等。人们可以通过简单的改变酶浓度或者添加抑制剂等方法来控制和调节酶反应的进行。第三节 酶的组成、分类与命名 一、酶的组成 除少数已经鉴定的具

6、有催化活性的RNA分子外，几乎所有的酶都是蛋白质，所以和其他蛋白质一样，酶也具有四级空间结构形式。根据酶的组成成分可以将酶分为三类： 1.单体酶单体酶是指仅有一个活性部位的多肽链构成的酶，其分子量在1300035000之间。这类酶很少，且都是水解酶，如胰蛋白酶等 第三节 酶的组成、分类与命名 2.寡聚酶 这类酶由若干相同或者不同的亚基组成，这些亚基一般没有活性，必须相互结合后才有活性，其分子量从35000至几百万，如3-磷酸甘油醛脱氢酶等。 3.多酶复合体 多酶复合体是指由多种酶彼此嵌合形成复合体进行连续反应的体系。这种多酶复合体有利于一系列反应的进行，其分子量很高，一般都在几百万以上。第三节

7、 酶的组成、分类与命名 有些酶的活性仅仅决定于其本身的蛋白质结构，这类酶属于简单蛋白质，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及核糖核酸酶等。大多数酶只有在与非蛋白组分结合后才表现出酶的活性，这类酶属于结合蛋白质，其非蛋白组分称为辅助因子。酶蛋白和辅助因子结合后所形成的复合物称为全酶。全酶可以表示如下：全酶=酶蛋白 + 辅助因子第三节 酶的组成、分类与命名 在催化反应中，酶蛋白与辅助因子所起的作用不同，酶反应的专一性取决于酶蛋白本身，而辅助因子本身无催化能力，其作用是在酶促反应中传递电子、原子或某些化学集团，维持酶的活性和完成酶的催化过程。辅助因子可以是金属离子（如铁、铜、锌、镁、钙、钾、钠等），也

8、可以是有机化合物。有机辅助因子可以依据其与酶蛋白结合的程度分为辅酶和辅基。前者为松弛结合，可透析除去,如NAD+、NADP+、CoQ、硫辛酸、生物素等；后者为紧密结合，如FMN、FAD等。二者的区别只在于它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，并无明显界限。 第三节 酶的组成、分类与命名 二、酶的命名 酶的命名通常有两种方法，即习惯命名法和系统命名法。 1.习惯命名法 1961年以前酶的命名都是采用习惯命名法，其依据的原则主要有： （1）根据酶所作用的底物命名。 如催化水解淀粉的酶叫淀粉酶，催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶。有时还加上来源以区别不同来源的同一种酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。 第三节

9、酶的组成、分类与命名 （2）根据催化反应的性质及类型命名。 如氧化酶、转移酶、水解酶等。 （3）结合上述两个原则综合命名。 如催化琥珀酸脱氢反应的酶叫琥珀酸脱氢酶等。 在许多情况下，这种习惯的、非系统的或末指明催化性质的命名法是不甚合理的，经常会出现一种酶多个名称或一个名子多个酶共用的情况。为了适应酶学的发展，避免上述情况的发生，国际酶学委员会于1961年提出了一套系统的命名方案和分类原则。第三节 酶的组成、分类与命名 2.国际系统命名法 按照国际系统命名法，每一种酶有一个系统名称和一个习惯名称。酶的系统名称应当明确标明酶的底物及催化反应的类型。例如乳酸脱氢酶的反应为：L-乳酸 + NAD+=

10、丙酮酸 + NADH + H+ 这个反应的底物是L-乳酸和NAD+，类型是氧化还原反应。因此这个酶的系统名称为：L-乳酸：NAD+氧化还原酶。第三节 酶的组成、分类与命名 三、国际系统分类法及编号 国际系统分类法中的分类原则是： 根据酶所催化反应的性质，把酶分为六大类，分别用1、2、3、4、5、6的编号来表示（如表1-1）； 根据底物中被作用的基团或键的特点再将每一大类分为若干亚类； 每一亚类中再分为若干小类； 每一小类中包含若干个具体的酶。第三节 酶的组成、分类与命名表1-1 酶的国际分类 第三节 酶的组成、分类与命名 根据国际系统命名法，每一种酶除了有一个系统名称外，还有一个系统编号，其系

11、统编号由四个数字组成，数字之间用“.”隔开。第一个数字表示该酶属于六大类中的哪一类；第二个数字表示该酶属于此大类中的哪一个亚类；第三个数字表示该酶属于上述亚类的哪一个小类；第四个数字表示这一具体的酶在该小类中的序号。编号之前往往加注EC，EC是国际酶学委员会（Enzyme Commission）的缩写。如胰蛋白酶的系统编号为EC3.4.21.4，第一个数字“3”表示该酶是水解酶（第三大类）；第二个数字“4”表示它是水解酶的第四亚类，催化的反应类型为水解肽键；第三个数字“21”表示该酶属于第四亚类中的第二十一小类，此小类为丝氨酸蛋白酶，在活性部位上有一至关重要的丝氨酸残基；第四个数字“4”表示该

12、酶是这一小类中的特定序号。当酶的编号仅有前三个数字时，就已经清楚地表明了这个酶的特性：反应性质、底物性质、键的类型。 第三节 酶的组成、分类与命名 六、大类酶简介如下： 1.氧化还原酶（oxido-reductases）氧化还原酶催化氧化还原反应，其催化反应的通式为 被氧化的底物（A-）为氢或电子供体，被还原的底物（B）为氢或电子受体。系统命名时，将供体写在前面，受体写在后面，然后再加上氧化还原酶字样，如黄嘌呤：氧化还原酶（习惯名为黄嘌呤氧化酶）。 第三节 酶的组成、分类与命名 氧化还原酶在体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成。重要的主要有各种脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶等。 第三

13、节 酶的组成、分类与命名 2.转移酶（transferases） 转移酶催化功能基团的转移反应，其催化反应的通式为 AB+C-A+BC 这类酶的系统命名是“供体：受体某基团转移酶”，如丙氨酸：酮戊二酸氨基转移酶（习惯名为谷丙转氨酶） 第三节 酶的组成、分类与命名 转移酶在体内将某基团从一个化合物转移到另一个化合物，参与核酸、蛋白质、糖类以及脂肪的代谢与合成。重要的主要有酰基转移酶、糖苷基转移酶、酮醛基转移酶、磷酸基转移酶、含氮基转移酶、含硫基团转移酶等。 3.水解酶（hydrolases） 水解酶催化水解反应，其催化反应的通式为AB+H2OAH+B-OH 水解酶的系统命名是先写底物的名称，再写

14、发生水解作用的化学键位置，其后再加上水解酶即可，如核苷酸磷酸水解酶等。这类酶在体内外起降解作用，一般不需要辅酶，是人类应用最为广泛的酶。重要的有糖苷酶、肽酶以及各种脂肪酶等。 第三节 酶的组成、分类与命名 4.裂合酶（lydses） 裂合酶催化一个化合物裂解成为两个较小化合物及其逆反应，其催化反应的通式为 A+BAB 这类酶的系统命名为“底物-裂解的基团-裂合酶”，如柠檬酸裂合酶（柠檬酸合成酶） 裂合酶可脱去底物上某一基团而形成一个双键，或可相反地在双键处加入某一基团，重要的有醛缩酶、水化酶、脱氨酶等。第三节 酶的组成、分类与命名 5.异构酶（isomerases） 异构酶催化各种同分异构体的

15、相互转化，其催化反应的通式为AB 异构酶按照异构化的类型不同分为六个亚类，命名时分别在底物名称后加上异构酶、消旋酶、变位酶、表异构酶、顺反异构酶等，如木糖异构酶。 此类酶是为了生物代谢的需要而对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构、酮醛异构、分子内裂解、分子内转移等。 第三节 酶的组成、分类与命名 6.连接酶或合成酶（ligases） 连接酶能催化一切必须与ATP分解相偶联，并由两种物质合成一种物质的反应，其反应通式为A+BAB 这类酶的系统命名是在两个底物的名称后面加上连接酶，如谷氨酸氨连接酶等。 连接酶关系着很多生命物质的合成，其特点是需要ATP等高能磷酸酯作为结合能

16、源。 有关酶的系统分类的更详细的知识可查阅有关专门著作。 酶 工 程第二章 酶动力学 第一节 酶促反应动力学 一、单底物动力学 k3在单底物酶促反应中，底物（S）首先与酶（E）结合，生成底物和酶的复合物（ES），然后复合物分解，形成产物（P）并释放出酶，这个过程可表示如下： 式中酶与底物形成复合物的反应是可逆反应，正反应和逆反应的速度常数分别为k1、k2，复合物分解为产物与酶的反应是不可逆反应，速度常数为k3。 第一节 酶促反应动力学 对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度S下，反应速度（v）直接与底物浓度S成正比；在高底物浓度S下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速度与底物浓度

17、S无关（如图2-1）。 图2-1 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度的关系 第一节 酶促反应动力学 1913年前后，米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten）在前人工作的基础上，通过大量的定量研究，提出了酶促动力学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方程，推导过程如下：根据上述反应式，中间产物ES的生成速度(底物S的消失速度)v1k1SEk2ES （2-1） 而ES的消失速度(产物P的生成速度) v2k3 ES，当反应达到平衡时，即v1v2时k1SEk2ES= k3 ES （2-2） 整理后得 第一节 酶促反应动力学 令Km = ， 则得Km = （2-4） 若酶的总浓度用Et表示，那

18、么 E= EtES，代入式（2-4）并整理得 （2-5） 由于酶的反应速度与ES成正比，所以 V = k3 ES （2-6） 将（2-5）代入（2-6），得 （2-7） 第一节 酶促反应动力学 当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则Et=ES。此时反应速度达到最大Vmax，即 Vmax= k3 ES= k3Et （2-8）（2-7）除以（2-8），并整理得 （2-9） 这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下式： 第一节 酶促反应动力学

19、整理上式可得 Km= S 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得： 对于很多酶而言，上式中的k2比k3大得多，此时的Km的值依赖于酶与底物的复合物ES生成和解离的速度常数k1和k2的相关值。高的Km表示弱的底物结合（k2远远大于k1），低的Km表示强的底物结合（k1远远大于k2）。 第一节 酶促反应动力学 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度呈双曲线关系，不易

20、直接求出Vmax和Km的值，通常采用双倒数法进行参数估计。将米氏方程改写成以下形式以 对作图，绘出曲线，横轴截距即为值，纵轴截距则是 （图2-2）。第一节 酶促反应动力学图2-2 双倒数作图 第一节 酶促反应动力学 二、多底物动力学 通常情况下，酶催化反应涉及两个(少数情况下三个)底物。现在我们考虑一个涉及两种底物和两种产物的酶促反应，其反应通式如下: AB PQ E 这样的酶促反应又称为双底物反应。现在已知的生化反应中有六成以上属于这一种反应。双底物反应的机理有下面三种可能： 第一节 酶促反应动力学 1.有序反应机理(ordered reaction) 这种情况下，A和B分别可被说成是先导底

21、物和后随底物，Q是A的产物，最后被释放。A和Q竞争同游离酶E结合，但A和B则不会（或者Q和B也不会）发生竞争（如图2-3）。依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或NADP）的脱氢酶的反应就属于这种类型。图2-3 有序反应机理 第一节 酶促反应动力学 2.随机反应机理（random reaction） 这种类型中，A和B两个底物无论哪个先同酶结合都没关系；同样地，产物P和Q谁先释放也不重要（如图2-4）。某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。图2-4 随机反应机理 第一节 酶促反应动力学 3.乒乓反应机理（ping pong reaction） 在乒乓催化反应中，第一个底物A(相当于P-X)的功

22、能基团(X)被酶从底物上置换，产生第一个产物P和一个稳定的酶形式F(相当于E-X)，在F中，X是紧密地(往往共价地)同酶结合；在反应的第二阶段，X被第二种底物B从酶分子上取代，生成第二个产物Q(B-X)，酶也恢复到最初的形式（如图2-5）。需要注意的是，在乒乓反应中，底物A和B并不彼此在酶分子上相遇。包括转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制。 图2-5 乒乓反应机理 实际上，多底物酶促反应动力学是非常复杂的，以上只是作以简要介绍，有关详细内容，可查阅相关专著。 第二节 影响酶促反应的因素 酶在催化反应中不能改变反应的平衡，但可以加快反应速度。要想在实际生产中最好地用好酶，让其发挥最大

23、的作用，达到比较小的成本也能生产出同样价值量的产品，必须对影响酶促反应的主要因素有充分而准确的认识。 影响酶促反应的主要因素有：底物浓度、酶浓度、温度、pH值以及激活剂、抑制剂等等 。第二节 影响酶促反应的因素 一、底物浓度对酶促反应的影响 底物浓度是决定酶催化反应的主要因素。早在20世纪初，人们就已经观察到了底物浓度对酶促反应表现出特殊的饱和现象，而这种情况在非酶促反应中则是不存在的。 底物浓度的变化对酶促反应速度的影响比较复杂。在酶浓度不变的条件下，底物浓度S与反应速度v的相互关系如图2-6所示。图2-6 底物浓度与酶反应速度的关系 s第二节 影响酶促反应的因素 从上图可以看出，在低的底物

24、浓度时，底物浓度增加，反应速度随之急剧增加，反应速度与底物浓度成正比，此时米氏方程可简化为 当底物浓度较高时，增加底物浓度，反应速度虽随之增加，但增加的程度不与底物浓度成正比；当底物达到一定浓度后，若再增加其浓度，则反应速度将趋于恒定（v= Vmax），并不再受底物浓度的影响，此时的底物浓度巳达到饱和程度。所有的酶都有这种饱和现象，但各自达到饱和时所需要的底物浓度各不相同，甚至差异极大。 第二节 影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影响可以设想为当底物浓度低时，酶的活性中心没有全部与底物结合，因此，反应速度随着底物浓度的增加而加快；当底物浓度增加到可占据全部酶的活性中心时，反应速度即达到最

25、大值(临界速度)，此时底物的浓度称为饱和浓度。高于饱和浓度时，由于酶的活性中心已全部为底物占据，故增加底物浓度不能继续提高反应速度。 在实际生产中，为节省成本，缩短时间，一般以过量的底物在短时间内达到最大的反应速度。第二节 影响酶促反应的因素 二、酶的浓度对酶促反应的影响 在底物浓度饱和的情况下（即所有的酶分子都与底物结合），酶催化反应速度与酶浓度成正比（如图2-7）。它们之间的关系可以表示为v = k E 酶反应速度与酶浓度的正比关系是由于在酶进行催化时，酶首先要与底物形成中间产物，即酶-底物复合物（ES），而这一步则是整个反应的限速步骤。当底物浓度大大超过酶浓度时，这种中间产物生成的速度取

26、决于酶的浓度，所以，如果此时增加酶的浓度可增加反应速度，即酶反应速度与酶浓度成直线的正比关系。 第二节 影响酶促反应的因素 生产中底物浓度一般是过量的，所以反应速度取决于酶浓度，而酶的实际用量又是同发酵工艺的制订及生产效益结合起来考虑的，一般应根据具体情况而定。 E图2-7 酶浓度与酶反应速度的关系第二节 影响酶促反应的因素 三、温度对酶促反应的影响 温度对酶的影响是非常复杂的，它能影响酶反应中功能团的解离状态、酶-底物复合物的裂解速度、酶对激活剂和抑制剂的亲和力等等。如果让酶反应在不同温度条件下进行，将测得的反应速度（v）相对温度（t）作图可得一钟形曲线（如图2-8）。它表明，在较低的温度范

27、围内，酶反应速度随温度升高而增大，但超过一定温度后，反应速度反而下降。反应速度发生转折时的温度就称为酶反应的“最适温度”。不同种类不同来源的酶，其最适温度有很大差别。从温血动物组织中提取的酶，最适温度一般在3540之间；植物酶的最适温度稍高，多在4050之间；从细菌中分离出来的某些酶最适温度可达70。人体内酶最适温度一般在37左右。第二节 影响酶促反应的因素 在达到最适温度之前提高温度，可以增加酶促反应的速度。反应温度每提高10酶反应速度就增加12倍。图2-8 温度与酶反应速度的关系第二节 影响酶促反应的因素 温度对酶促反应有两个方面的影响：一方面，在其他条件一定的情况下，当温度升高时，反应速

28、度加快，直至最大速度为止；另一方面，酶是生物大分子，会随着温度的升高而逐步变性，甚至最终丧失其催化活性，也就是说，通过减少有活性的酶而降低反应速度。酶反应的最适温度就是这两个过程的综合平衡的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主；在高于最适温度时，后一种效应明显，因而会出现酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。大多数酶在温度超过60时就会变性。然而，也有少数酶能耐受较高的温度，如耐高温的-淀粉酶在90甚至更高的温度条件下，仍然能正常发挥其催化作用。聚合酶链反应中被广泛使用的Taq聚合酶在95条件下仍然可以进行稳定催化。牛胰核糖核酸酶甚至加热到100仍不失活。在实际生产中，通常采取增加酶反应的底物或

29、者添加某些稳定剂来提高酶的热稳定性。 第二节 影响酶促反应的因素 酶的活性虽然随着温度的降低而减弱，但低温一般不破坏酶，只是酶的催化活性很微弱，当温度回升后，酶又恢复其活性。临床上的低温麻醉就是利用低温能降低酶的活性，以减慢组织细胞的代谢速度，提高机体对氧和营养物质缺乏的耐受性，有利于手术治疗。低温保存菌种和生物制品也是基于同一原理。 对于一种具体的酶而言，其最适温度并不是一个固定值，而与酶作用的时间长短有关。酶可以在较短的时间内耐受较高的温度，但是只有当酶反应时间在被规定的情况下，才有最适温度。也就是说，即使是同一种酶，如果反应的时间不同，其最适温度也不一样。一般来说，酶在干燥情况下要比潮湿

30、状态下更耐高温。这一点已被广泛用于指导酶的储藏保存。有些酶的干粉剂可以在室温下放置一段时间，而其水溶液则必须在冰箱中保存；制成冰冻干粉的酶制剂能放置数月，而未制成这种干粉的酶溶液在冰箱中只能保存几天。第二节 影响酶促反应的因素 四、pH值对酶促反应的影响 酶反应都是在一定的pH条件下进行的，即酶的活性会随着其环境pH的变化而变化，每一种酶只能在一定的pH范围内表现出它的活性，而且在某一pH下，酶活性最高，通常称此pH为该酶反应的最适pH（如图2-9）。溶液的pH偏离最适pH时，酶的活性降低，偏离最适pH愈远，酶的活性就愈低。若pH过高或过低达一定程度，则可导致酶的变性而失活。因此，测定酶活性时

31、，常选择适宜的缓冲剂，以维持其pH的相对恒定。图2-9 pH对酶活性的影响第二节 影响酶促反应的因素 酶的最适pH并不是一个常数，它往往因酶的纯度、底物种类和浓度以及环境介质的成分不同而不同。因此，酶的最适pH只在一定的条件下才有意义。大多数酶的最适pH在68之间，动物酶多在6.58.0之间，植物和微生物酶多在4.56.5之间。也有少数例外，如胃蛋白酶为1.5，肝脏中的精氨酸酶则为9.7。几种常见酶的最适pH见表2-1。 pH对酶活性产生影响的原因存在以下几方面的可能： 1.氢离子与氢氧根离子的浓度会影响到酶蛋白构象的变化，甚至能够导致酶变性而失活。 2.pH能够影响到酶分子中某些基团的解离，

32、这些基团的离子化状态与酶分子的活性中心构象有关。 第二节 影响酶促反应的因素 3.pH会影响到底物分子的解离状态，同时也会影响酶分子的解离状态，从而对酶与底物的亲和力产生影响。 值得注意的是酶在试管中反应的最适pH与其所在正常细胞的生理pH值不一定是相同的。这主要是因为一个细胞中有数百种酶，不同的酶对细胞内的生理pH值的敏感性不一样，对有些酶而言可能已达到或者接近其最适pH，而对另一些酶则不是，这就致使不同的酶表现出不同的活性。这种不同被认为对细胞内复杂的各种代谢活动有重要意义。第二节 影响酶促反应的因素表2-1 几种常见酶的最适pH 第二节 影响酶促反应的因素 五、其它因素的影响 酶促反应除

33、受上述的底物浓度、酶浓度、温度、pH的影响外，还受到激活剂、抑制剂等其他因素的影响。 1.激活剂的影响在酶促反应中，很多离子或一些简单有机化合物能够提高或者激活酶的活性，这类物质被称为激活剂。激活剂大致可分为下面几类： （1）无机离子 主要是一些金属离子，如Na+、K+、Mg+、Zn2+、Ca2+、Fe2+等。少数阴离子也有一定的激活作用，但作用不明显。 （2）有机小分子 包括半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氰化物等某些还原剂以及螯合物乙二胺四乙酸（EDTA）等。 （3）具蛋白质性质的大分子物质 主要指对某些无活性的酶原起作用的酶。激活剂对酶的作用有一定的选择性，也就是说，一种激活剂对某种酶有激活作

34、用，而对另一种酶则不一定有激活作用，甚至还有抑制作用。 第二节 影响酶促反应的因素 2.抑制剂的影响 抑制剂是指能够使酶催化活性降低或者丧失的物质。它是对酶反应速度有十分重要影响的一种因素。抑制是指抑制剂与酶的活性有关部位结合后，改变了酶活性中心的结构(构象)与性质，从而引起酶活力下降的一种效应。引起抑制效应的这些物质就是抑制剂。需要注意的是酶蛋白水解与变性不属于抑制范畴。 抑制剂的种类很多。有些抑制剂是细胞正常代谢的产物，它可以作为某一种酶的抑制剂，成为细胞代谢途径中正常调控的一部分。例如，色氨酸抑制色氨酸合成途径中第一步反应所需酶（邻氨基苯甲酸合成酶）的催化活性，从而调节色氨酸的生物合成。

35、大多数的抑制剂都是外源物质，主要是一些无机离子、小分子有机物和蛋白质等，如银（Ag+）、汞（Hg2+）、铅（Pb2+）等重金属离子和胰蛋白酶抑制剂等等。酶的抑制效应可以作为药物在医疗上发挥重要作用，但有时又会出现极端现象，危及生命。第二节 影响酶促反应的因素 酶的抑制作用主要有以下两种类型： （1）不可逆的抑制作用（irreversible inhibition） 抑制剂不可逆地与酶结合，通常是与酶蛋白中的基团结合形成共价键，使酶失活，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶的活性。如抗生素青霉素能够与细菌细胞壁上的糖肽转肽酶活性部位的丝氨酸残基结合，形成交联结构，从而不可逆的抑制该酶的活

36、性。 （2）可逆的抑制作用（reversible inhibition） 可逆的抑制作用是指某些抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透析法将抑制剂除去，从而恢复酶的活性。在可逆抑制作用中，抑制剂与游离状态的酶之间存在着一种平衡关系。根据作用的机制不同，酶的可逆性抑制作用又可以分为三种，即竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。 第二节 影响酶促反应的因素 竞争性抑制（competitive inhibition） 这是一种抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。在这种抑制作用中，抑制剂和底物结构相似，由于酶的活性中心不能和抑制剂及底物同时作用，当抑制剂与酶分子结合后，底物分子就不能再与酶

37、分子结合。这是一种最为常见的可逆性抑制作用。最为典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制，丙二酸与该酶的正常底物琥珀酸结构上相似，二者可以竞争性的与该酶结合。琥珀酸和丙二酸结构式如下：第二节 影响酶促反应的因素 竞争性抑制作用可以通过增加底物的浓度来加以解除。这种抑制作用的特点是酶催化反应的最大反应速度Vmax不变，而米氏常数Km增大（如图2-10）。 图2-10 竞争性抑制作用的特性 第二节 影响酶促反应的因素 非竞争性抑制（noncompetitive inhibition） 这种抑制作用是指非竞争性抑制剂可逆的与酶分子上除活性部位以外的其他位点结合，改变酶分子总的三维形状，从而引起酶活性降

38、低。非竞争性抑制作用的实例是抑胃酶素对肾素的作用。 由于非竞争性抑制剂是与酶分子活性部位以外的位点结合，其分子结构可能和底物分子的结构无任何关系，因此，增加底物浓度也不能解除非竞争性抑制。非竞争性抑制的特点是酶催化反应的最大反应速度Vmax减小，而米氏常数Km不变（如图2-11）。图2-11 非竞争性抑制作用的特性第二节 影响酶促反应的因素 反竞争性抑制（uncompetitive inhibition） 反竞争性抑制是指只有在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合才能够引起的抑制作用。 这类抑制剂不能直接与酶分子结合，只有当底物与酶分子结合引起酶分子结构发生变化后，使抑制

39、剂的结合部位显现出来，抑制剂才能结合，从而产生抑制作用。因此，反竞争性抑制不能通过增加底物浓度来加以解除。反竞争性抑制的特点是酶催化反应的最大反应速度Vmax和米氏常数Km同时减小（如图2-12）。图2-12 反竞争性抑制作用的特性 第二节 影响酶促反应的因素 为便于比较和掌握，现将可逆抑制作用和无抑制剂作用各种情况下的最大反应速度Vmax和米氏常数Km的变化小结于表2-2中。表2-2 有无抑制剂存在时酶促反应Vmax和Km的变化比较 影响酶促反应的因素除上面所述以外，其实还有很多，如压力、离子辐射等等，这里不再作过多讲解。 酶 工 程第三章 酶的发酵生产第一节 酶生物合成的基本理论 一、RN

40、A的生物合成转录某种细胞能否合成某种酶分子。首先取决于细胞中的遗传信息载体DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。 DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录生成对应的RNA，然后再翻译成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。 转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA的过程。 第一节 酶生物合成的基本理论 转录时，RNA聚合酶首先结合到DNA的特定位点（启动基因）上，DNA的双螺旋链部分解开，以其中一条链为模板，通过碱基互补方式结合进第一个核苷三磷酸，然后随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋逐渐解开，按照模板上的碱基顺序逐个加入与其

41、互补的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸链。在RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸链立即与模板分开，DNA分子的两条链又重新缠绕形成双螺旋。（图3-1） 图3-1 RNA的生物合成转录示意图转录生成的DNA按其结构和功能的不同，可以分成mRNA，tRNA和rRNA等3种。第一节 酶生物合成的基本理论 二、蛋白质的生物合成翻译 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各 种tRNA，酶和辅助因子的作用合成多肽链的过程，称为翻译。 翻译是将RNA分子上的碱基排列次序转变为多肽链上氨基酸的排列次序的过程。不同的生物，其翻译过程有些差别。现已大肠杆菌为例，说明翻译的基本过程。 翻译过程分为4个阶段。

42、 1.氨基酸活化生成氨酰-tRNA 氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的作用下，与特定的tRNA合，生成氨酰-tRNA。此过程由ATP提供能量，其反应如下：第一节 酶生物合成的基本理论 aa+tRNA+ATP 氨酰-tRNA合成酶 aa-tRNA+AMP+PPi 对于大肠杆菌而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸。它是在甲硫氨酸与tRNA结合后，再经甲酰化而成。即： Met+tRNA +ATPMet-tRNA +AMP+PPi Met-tRNA再经甲酰转移酶EC2.1.2.9的作用，甲酰化而生成甲酰甲硫氨酰-Trna（fMet-tRNA）。 2.肽链合成的起始 肽链合成的起始阶段是在GTP和

43、起始因子(Initiation Factor)的参与下,核糖体30s亚基, fMet-tRNA,mRNA和50s亚基结合，组成起始复合物的过程。这一阶段包括5个步骤： 第一节 酶生物合成的基本理论 （1）30s亚基与起始因子IF3结合； （2）30s亚基与mRNA结合，形成30s-IF3-mRNA复合物 （3）fMet-tRNA与起始因子IF2以及GTP结合； （4）在起始因子IF1的参与下，fMet-tRNA-IF2-GTP与 30s- IF3-mRNA结合生成30s起始复合物，在此30s起始复合物中，fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子AUG上； （5）50s亚基与上述30s起始

44、复合物结合，形成具有完整结 构的70s核糖体。在此过程中，同时放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70s核糖体形成时，fMet-tRNA位于70s核糖体的“P”（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。第一节 酶生物合成的基本理论 蛋白质合成的起始阶段的示意图如图3-2所示。第一节 酶生物合成的基本理论第一节 酶生物合成的基本理论 3肽链的延伸 在延伸因子（Elongation Factor）的参与下，与mRNA上密码子对应的氨酰-tRNA进入70s核糖体之中的“A”位。通过肽链合成酶的作用，P位上fMettRNAF 的甲酰甲硫氨酰（fMet）与A位上的氨酰-

45、tRNA(aa1-tRNA1)以肽键结合，形成肽酰-tRNA。接着，mRNA和核糖体作相对移动，A位上的肽酰-tRNA转至P位上，而原在P位上的t-RNAF游离出去。然后，根据mRNA上密码编排，下一个氨酰-tRNA进入A位，再重复上述过程，使肽链不断延伸，直至终止密码子为止。其主要过程如下:第一节 酶生物合成的基本理论 （1）延伸因子EF-T与氨酰-tRNA(aa1-tRNA1)以及GTP结合；（2）aa1-tRNA1进入70s起始复合物的A位，同时放出EF-T，GDP和Pi;（3）肽合成酶催化P位上的fMet脱离 t-RNA，而与A位上的aa1-tRNA1通过肽链结合，形成肽酰-tRNA(

46、fMet-aa1-tRNA1)；（4）在延伸因子EF-G和GTP的参与下，mRNA与70s核糖体作相对移动，使原在A位上的fMet-aa1-tRNA1位移至P 位，A位成为空位，同时放出EF-G、GDP、Pi以及tRNAF。然后下一个氨酰-tRNA（aa2-tRNA2）进入A位，重复上述（3）（4）步骤，如此往复，使肽链不断延伸（图3-3）。 第一节 酶生物合成的基本理论 图3-3 肽链的延伸第一节 酶生物合成的基本理论 4肽链合成的终止 随着肽链的延伸，mRNA与70s核糖体不断地作相对移动。当mRNA分子中的终止密码子（UAA，UAG，UGA）移动到核糖体的A位时，没有相应的氨酰-tRNA

47、进入，此时释放因子（Release Factor）进入A位，并与终止密码子结合。据研究表明，释放因子有两种，其中RF-1可与UAA和UAG结合，而RF-2可与UAA和UGA结合。在释放因子进入A位后，已合成的完整肽链从P位转至A位时，被释放出来。随之70s核糖体解离成为30s亚基和50s亚基，可重新用于下一次肽链的合成。 新合成的肽链释放出来后，还需经过加工才能形成空间结构的酶或蛋白质。加工过程首先需经过肽脱甲酰酶的作用，使甲酰甲硫氨酸残基上的甲酰基除去。有时还需在氨肽酶的作用下，从肽链的N-末端切除一个或数个氨基酸残基，然后自动折叠卷曲成完整的空间结构。 第一节 酶生物合成的基本理论 三、酶

48、生物合成的调节 如上所述，酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要诸多因素的参与。故此，在转录和翻译过程中，许多因素都会影响酶的生物合成。那么，究竟哪些因素对酶的生物合成起主要的调节控制作用呢？研究结果表明，至少在原核生物中，甚至在所有生物中，转录水平的调节控制对酶的生物合成是至为重要的。 转录水平调节控制，又称为基因的调节控制。这种控制理论最早是由雅各（Jacob）和莫诺德(Monod)于1960年提出的操纵子学说来阐明的，1966年发现了启动基因，使这一调节控制理论不断完善。第一节 酶生物合成的基本理论 根据基因调节控制理论，在DNA分子中，与酶生物合成有密切关系的基因有4种。它们是调节基因(

49、Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基因(Operator gene)和结构基因(Strutural gene)。其中，结构基因与酶有各自的对应关系，结构基因中的遗传信息可转录成mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链。操纵基因可以特异性地与调节基因产生的边构蛋白（阻抑蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶合成的时机及速度。结构基因与操纵基因一起称为操纵子。启动基因决定酶的合成能否开始，启动基因由两个位点组成，一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸接受蛋白（CRP）的复合物（cAMP- CRP）的结合位点。只有在cAMP

50、- CRP复合物结合到启动基因的位点上时，RNA第一节 酶生物合成的基本理论 聚合酶才能结合到其在启动基因的位点上，这样，酶的合成才有可能开始，否则酶就无法开始合成。调节基因可以产生一种阻抑蛋白，阻抑蛋白是一种变构蛋白,它可以通过与低分子作用物(诱导物或阻遏物)的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。当阻抑蛋白结合到操纵基因上时,RNA聚合酶即使已经结合到启动基因的位点上,也无法通过操纵基因而进入到结构基因位置,因而无法将遗传信息转录到mRNA上,酶就无法合成。只有当阻抑蛋白改变结构而不与操纵基因结合时,RNA聚合酶才有可能通过操纵基因,到达结构基因位置,进行转录,进而翻译成酶蛋

51、白多肽链。 基因对酶生物合成的调节控制有3种模式。即分解代谢物阻遏作用,酶合成的诱导作用以及酶合成的反馈阻遏作用。第一节 酶生物合成的基本理论 1.分解代谢物阻遏作用 分解代谢物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成现象。例如:葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的生物合成,果糖阻遏-淀粉酶的生物合成等。 分解代谢物阻遏作用之所以产生,这是由于容易利用的碳源过量存在时,通过代谢途径进行降解,放出的能量有一部分储存在ATP中，ATP是由ADP和AMP通过磷酸化作用生成的。这样细胞内ATP浓度增加，就使AMP浓度降低。由于cAMP可通过磷酸二酯酶作用，水解生成AMP。cAMP+H2O 磷酸

52、二酯酶 AMP 同时，cAMP的生成受阻，从而致使细胞中cAMP的浓度随AMP浓度的降低而降低。这必然使cAMP-CRP复合物的浓度也跟着降低。结果,在启动基因(P)上没有cAMP-CRP复合物结合,RNA聚合酶也就无法结合启动基因的位点上.就使结构基因(S)上的遗传信息无法转录,酶的生物合成无法进行。第一节 酶生物合成的基本理论 当容易利用的碳源不存在或被细胞用完后,随着细胞中ATP浓度的下降,而使ADP、AMP、cAMP的浓度增加。当cAMP-CRP的浓度增加到一定量的时候，cAMP-CRP复合物结合到启动基因的特定位点上，RNA聚合酶也随着结合到它的位点上，酶的生物合成就有可能进行。 由

53、此可见，分解代谢物阻遏作用及该阻遏作用的解除，实质是cAMP通过启动基因对酶生物合成的调节控制。 为此，在培养基中控制好容易利用的碳源的量，或在容易利用的碳源过剩时加进一定量的cAMP，均可防止或解除分解代谢物阻遏作用。 第一节 酶生物合成的基本理论 2酶生物合成的诱导作用 加进某中物质,使酶的生物合成开始或加速进行的过程,称为酶生物合成的诱导作用。简称为诱导作用。起诱导作用的物质，称为诱导剂。例如，乳糖诱导半乳糖苷酶的合成等。 酶生物合成的诱导作用过程如图3-4所示。 第一节 酶生物合成的基本理论第一节 酶生物合成的基本理论 图3-4酶生物合成的诱导作用（A）-无诱导物时 （B）-添加诱导物

54、时(B)第一节 酶生物合成的基本理论 在无诱导物存在时，调节基因（R）产生的阻抑蛋白与操纵基因（O）的结合力较强，当它们结合时，就使已经在启动基因（P）上的RNA聚合酶无法经过操纵基因位置而进入结构基因（S）的位置。因此遗传信息无法转录，酶不能合成。 当有诱导物存在时，诱导物与阻抑蛋白结合在一起，使阻抑蛋白结构发生改变，使之与操纵基因的结合力减弱。阻抑蛋白不能与操纵基因结合，就使RNA聚合酶可以顺利通过操纵基因位置而到达结构基因位置。进行转录生成mRNA，再进一步翻译成酶蛋白多肽链。 第一节 酶生物合成的基本理论 3酶生物合成的反馈阻遏作用 酶生物合成的反馈阻遏作用又称为产物阻遏作用，指的是酶

55、催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生 物合成受阻的过程。引起反馈阻遏的物质，称为共阻遏物。例如，无机磷酸是碱性磷酸酶的催化磷酸单酯水解的产物，而它的过量存在，却可阻遏碱性磷酸酶的生物合成；组氨酸作为组氨酸合成途径的终产物，它的过量积累却反过来对其合成途径中的10种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。 反馈阻遏作用的机理与诱导合成的机理相似。 如图3-5所示。第一节 酶生物合成的基本理论 图3-5 酶生物合成的反馈阻遏作用（A）-无阻碍物时 （B）-有阻碍物时第一节 酶生物合成的基本理论 在没有共阻遏物存在时，调节基因（R）产生的阻抑蛋白与操纵基因（O）的亲和力弱，不能与操纵基因结合，所以已结

56、合在启动基因（P）上的RNA聚合酶能顺利通过操纵基因位置到达结构基因（S）位置，进行转录，进而合成酶蛋白多肽链。 当共阻遏物达到一定浓度时，阻抑蛋白与共阻遏物特导结合，使其结构发生改变，而使阻抑蛋白与操纵基因的亲和力增强。当阻抑蛋白结合到操纵基因上时，就阻止RNA聚合酶通过，结果，结构基因上的遗传信息无法转录，这就使酶的合物合成受阻。第二节 酶发酵生产常用的微生物 任何生物都能在一定条件下合成某些酶。但是并不是所有的细胞都能用于酶的发酵生产。一般说来，能用于酶发酵生产的细胞必需具备如下几个条件：（1）酶的产量高。优良的产酶细胞首先要具有高产的特性，才有较好的开发应用价值。高产细胞可以通过筛选、

57、诱变、或采用基因工程、细胞工程等技术而获得。（2）容易培养和管理。要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制便于管理。（3）产酶稳定性好。在通常的生产条件下，能够稳定地用于生产，不易退化。一旦细胞退化，要经过复壮处理，使其恢复产酶性能。（4）利于酶的分离纯化。发酵完成后，需经分离纯化过程，才能得到所需的酶。这就要求产酶细胞本身及其它杂质易于和酶分离。（5）安全可靠。要求使用的细胞及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对酶的应用产生其他不良影响。第二节 酶发酵生产常用的微生物 现在大多数酶都采用微生物细胞进行发酵生产。微生物具有种类多，繁殖快，容易培养代谢能力强等特点，有不少

58、性能优良的产酶菌株已在酶的发酵生产中广泛应用。现把常用的产酶微生物简介如下： 一、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物之一。 枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞成干状，大小为（0.70.8）*（23），单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。菌落粗糙，不透明，污白色或微带黄色。此菌用途很广，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌BF7658是国内用于生产淀粉酶的主要菌株；枯草杆菌AS1.398可用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。枯草杆菌生产的淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。 第二节 酶发酵生

59、产常用的微生物 二、大肠杆菌（Escherichia coli） 大肠杆菌细胞呈杆状，大小为0.5 *（1.03.0），革兰氏染色阴性，无芽孢，菌落从白色到黄白色，光滑闪光，扩展。 大肠杆菌可生产多种多样的酶，一般都属于胞内酶，需经过细胞破碎才能分离得到。例如 ，谷氨酸脱羟酶，用于测定谷氨酸含量或生产r氨基丁酸；天冬氨酸酶，催化延胡索酸加氨生成L天冬氨酸；苄青霉素酰化酶，生产新的半合成青霉素或头孢霉素；半乳糖甘酶，用于分解乳糖；限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶，在基因工程方面应用。第二节 酶发酵生产常用的微生物 三、黑曲霉（Aspergillus niger） 黑曲霉是

60、曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。 黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。第二节 酶发酵生产常用的微生物 四、米曲霉（Aspergillus oryzae） 米曲霉是曲霉属黄曲霉丛霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑少数有刺，分生孢子梗长2mm左右，粗糙。 米曲霉可用于生产糖化酶和蛋白酶，这在我国传统的酒曲和酱油中得到广泛应用。此外