DNA多态性分型技术四川大学讲义ppt课件

1、LOGO第三节第三节 DNA多态性分型技术多态性分型技术四川大学华西公共卫生学院四川大学华西公共卫生学院 张薇薇张薇薇: solozww163. Q Q: 363002530 分型技术有那些分型技术有那些?- 血清学分型血清学分型 - 生物化学分型生物化学分型 - 噬菌体分型噬菌体分型. 传统的分型技术传统的分型技术分子生物学分型技术分子生物学分型技术?- PFGE- 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析- PCR技术技术- 质粒图谱质粒图谱脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE原原 理理 琼脂糖凝胶依托不同的分子筛效应对大小不同

2、的琼脂糖凝胶依托不同的分子筛效应对大小不同的DNA分子分子进展分别。超越一定大小的线状双链进展分别。超越一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中分子在琼脂糖凝胶中以一样速率迁移。以一样速率迁移。 大于该极限长度大于该极限长度40kb后后DNA的迁移速率几乎与分子的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决议于电场强度。但大小无关，而主要决议于电场强度。但 PEGE 处理了这一问处理了这一问题题原原 理理PFGE利用定时改动电场方向的交流电源，每次电利用定时改动电场方向的交流电源，每次电流方向改动继续流方向改动继续l s到到5min左右，然后改动电流方向左右，然后改动电流方向反复循环，故称为脉冲式交

3、变电场。随着电场方向反复循环，故称为脉冲式交变电场。随着电场方向的交替变化，的交替变化，DNA分子呈分子呈“Z形向前运动。每改动形向前运动。每改动一次电场方向，大的伸展的一次电场方向，大的伸展的DNA分子就必需重新定分子就必需重新定向，在新的方向上经过凝胶。重新定向所需的时间向，在新的方向上经过凝胶。重新定向所需的时间与与DNA分子的长度成正比。分子的长度成正比。B+A-+A-B脉冲电场电泳表示图脉冲电场电泳表示图1细菌培育细菌培育 2制备胶块制备胶块 3菌体裂解菌体裂解 4胶块洗涤胶块洗涤 5酶切酶切 6电泳电泳 7结果处置结果处置 PFGE图谱获得过程图谱获得过程最大限制的最大限制的保证全

4、基因保证全基因组的完好性组的完好性脉冲式交变脉冲式交变电场电场 PFGE 优势优势反复性好反复性好,分辨力强分辨力强,被誉为细菌分子生物学分型技术的被誉为细菌分子生物学分型技术的“金规范金规范 PFGE 的局限性的局限性 无法分辨点突变、微小突变无法分辨点突变、微小突变 内切酶选择很关键，否那么无法找到图谱内切酶选择很关键，否那么无法找到图谱 费时，仪器要求高，技术要求高，本钱较高费时，仪器要求高，技术要求高，本钱较高PFGE的优势和局限性的优势和局限性任何一种技术都不是完美的！任何一种技术都不是完美的！ 还有没有其他技术作为补充？DNA多态性多态性 ?分型技术分型技术?Yes!自然界的生物的

5、个体差别自然界的生物的个体差别我是独一我是独一无二滴无二滴!不同不同or 差别差别? 多态性多态性polymorphism定义定义: 是指在一个生物群体中，同时和经常存是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不延续的变异型或基因型或等在两种或多种不延续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性或基因多态性位基因，亦称遗传多态性或基因多态性 (genetic polymorphism). 从本质上来讲，多态性的产生在于基因程度从本质上来讲，多态性的产生在于基因程度上的变异，普通发生在基因序列中不编码蛋上的变异，普通发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调理功能的区域。白的区域和没有重要

6、调理功能的区域。 DNA多态性在微生物中的实践意义？多态性在微生物中的实践意义？将导致将导致 不同的细菌亚型不同的细菌亚型 耐药菌株出现耐药菌株出现 毒力变异株出现毒力变异株出现 抗原漂移与抗原变异抗原漂移与抗原变异 。在疾病预防控制中的运用在疾病预防控制中的运用同源性追踪同源性追踪细菌分型细菌分型传染控制传染控制DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析技术限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD) 细菌基因组反复序列细菌基因组反

7、复序列PCR技术技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析技术限制性片段长度多态性分析技术 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD) 细菌基因组反复序列细菌基因组反复序列PCR技术技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。 1974年首创，以年首创，以DNA-DNA杂交为杂交为根底的第一代遗传标志，是限制性内切根底的第一代遗传标志，是限制性内切酶、核酸电泳、印

8、迹技术、探针酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技杂交技术的综合运用术的综合运用 一、限制性片段长度多态性分析一、限制性片段长度多态性分析Restriction fragment length Restriction fragment length polymorphismpolymorphism，RFLP RFLP 因此，因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标志的化核酸及标志的DNA探针能与任何序列类似的片探针能与任何序列类似的片段杂交，经过片段长度变异性来检测生物体多态段杂交，经过片段长度变异性来检测生物体多态性性基基 本本 原原 理理 每种生物

9、基因型具有其独特的特征，及独特的每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限制酶识别序列分布，其基因组限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是延续陈列的，如用放射性片段经电泳以后几乎是延续陈列的，如用放射性同位素标志的同位素标志的DNA作探针，将与被标志的作探针，将与被标志的DNA相相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。核酸分子杂交技术原理核酸分子杂交技术原理v 核酸经加热变性后，在低于变性温度核酸经加热变性后，在低于变性温度20 30

10、20 30时，反响系统中参与的核酸探针时，反响系统中参与的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNADNA或或RNARNA构成双链构造，经过检测标志信号即构成双链构造，经过检测标志信号即可检测特定的核苷酸片段。可检测特定的核苷酸片段。 RFLP操作流程图操作流程图根本根本方法方法 转移电泳槽聚合酶链反响聚合酶链反响-限制性片段长度多态限制性片段长度多态性分析技术性分析技术 PCR-RFLP根本原理根本原理 结合结合PCR技术与技术与RFLP技术的优点，其根本原技术的优点，其根本原理是对目的基因片段理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制扩增后，利用多

11、种限制性内切酶，对扩增产物进展酶切，不同基因序列，性内切酶，对扩增产物进展酶切，不同基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同电泳图谱，经过对电泳图谱的分析，得出基因不同电泳图谱，经过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。多态性结果。2022-5-8四川大学华西公卫 裴晓方 26Kary Mullis1993 年因此荣获诺贝尔化学奖年因此荣获诺贝尔化学奖 v聚合酶链反响是在体外酶促扩增特定聚合酶链反响是在体外酶促扩增特定DNA或或RNA片段的技术。片段的技术。 v由变性由变性 、 退火退火 、 延伸三个根本步骤构成延伸三个根本步骤构成

12、 PCR反响五要素的优化反响五要素的优化 1、多聚核苷酸引物、多聚核苷酸引物 2、Taq DNA聚合酶聚合酶 3、dNTP三磷酸脱氧核苷酸三磷酸脱氧核苷酸 4、模板核酸、模板核酸 5、缓冲液、缓冲液基基 本本 程程 序序1. 提取提取DNA2. 设计特异引物进展目的基因设计特异引物进展目的基因PCR反响反响3. 将将DNA扩增产物选用适宜限制性内切酶酶切扩增产物选用适宜限制性内切酶酶切4. 将酶切出来的具各种长度的将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂片段在琼脂 糖凝胶上电泳分别糖凝胶上电泳分别5. 对显示出来的带谱进展分析。对显示出来的带谱进展分析。 RFLP与与PCR-RFLP的运用的运

13、用 结核分枝杆菌结核分枝杆菌IS6110-RFLP分析分析 厌氧菌厌氧菌16SrRNA基因基因PCR-RFLP分析分析 其他其他 我的肥胖课题我的肥胖课题PPAR-2及及UCP2基因多态性与成都地域基因多态性与成都地域单纯性肥胖相关性初探单纯性肥胖相关性初探 PPAR-2 调理脂肪组织分化，脂质代谢方面发扬关键调理脂肪组织分化，脂质代谢方面发扬关键作用作用 其基因突变发生于染色体其基因突变发生于染色体3p25 外显子外显子2的第的第12位密码子位密码子CCA-GCA突变突变 呵斥脯氨酸转变为丙氨酸，即呵斥脯氨酸转变为丙氨酸，即PA多态性多态性 UCP2 调理机体的根底代谢率调理机体的根底代谢率

14、(BMR)来控制体重来控制体重 其定位于人类其定位于人类11号染色体号染色体(11q13) 外显子外显子2 ，第，第55位密码子位密码子GCA-GTA突变突变 呵斥丙氨酸转变缬氨酸，即呵斥丙氨酸转变缬氨酸，即AV多态性多态性v v 600bp v 500bpv 400bpv 300bp v 250bpv 200bpv 150bp 126bpv 100bp 98bpv v Maker 1 2 3v图9 UCP2 PCR产物经Bbv内切酶酶切后3.5%琼脂糖凝胶电泳结果v注：基因型为AA型:被酶解为98bp,1条带(第3泳道);v 基因型为AV型:被酶解为126bp、98bp，2条带(第1泳道)v

15、 基因型为VV型:被酶解，仍为126bp l条带(第2泳道)A VV VAADNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD) 细菌基因组反复序列细菌基因组反复序列PCR技术技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。 二、扩增片段长度多态性分析技术二、扩增片段长度多态性分析技术Amplified fragment length polymorphism，AFLP 结合了限制

16、性酶切消化的可靠性和严厉的结合了限制性酶切消化的可靠性和严厉的PCR退火条件，有高度特异性，既抑制了退火条件，有高度特异性，既抑制了RFLP技技术中术中Southen杂交繁琐和耗时的缺陷，又处理了杂交繁琐和耗时的缺陷，又处理了RAPD等技术中非特异等技术中非特异PCR扩增引起的可信度问题。扩增引起的可信度问题。 AFLP技术的发明技术的发明基基 本本 原原 理理 AFLP指纹图谱是经过指纹图谱是经过PCR技术扩增基因组技术扩增基因组DNA限制性酶切片段，然后在高分辨率聚丙烯酰限制性酶切片段，然后在高分辨率聚丙烯酰胺凝胶或毛细管凝胶中电泳而获得。胺凝胶或毛细管凝胶中电泳而获得。 AFLP技术检测

17、的是酶切位点单核苷酸改动技术检测的是酶切位点单核苷酸改动或其临近的用于或其临近的用于AFLP引物退火的核苷酸改动所引物退火的核苷酸改动所致的序列多态性。致的序列多态性。补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图基因组基因组DNA提取提取酶切与接头衔接酶切与接头衔接PCR扩增扩增电泳分析电泳分析根本程序根本程序例子：例子：EWGLIEWGLI制定的军团菌制定的军团菌AFLPAFLP分型规范方法分型规范方法1. 1. 细菌培育和模板制备细菌培育和模板制备 初次分别的军团菌单个菌株在初次分别的军团菌单个菌株在BCYE-BCYE-琼琼脂平板上二次传代，脂平板上二次传代，3537353

18、7培育培育23d23d，确定为，确定为纯培育。挑取次代纯培育菌落用纯培育。挑取次代纯培育菌落用Nucleon BACC2Nucleon BACC2配套配套DNADNA提取液，提取液，RNase ARNase A酶消化后提取基因组酶消化后提取基因组DNADNA。在。在260nm260nm吸光度测定基因组吸光度测定基因组DNADNA浓度。浓度。 2. 限制性酶切与衔接反响限制性酶切与衔接反响 限制性酶切与衔接反响体系包括基因组限制性酶切与衔接反响体系包括基因组DNA、接头、接头AFLP-LG15-CTCGTAGACTGCG TACATGCA-3、接、接头头AFLP-LG25-TGTACGCAGTC

19、TAC-3、Pst酶、酶、T4衔接酶、衔接酶、1酶衔接缓冲液，酶衔接缓冲液，37反响反响3h。 与接头衔接好的标志与接头衔接好的标志DNA片段用片段用2.5mol/L醋酸胺、纯乙醇沉淀。室温孵育醋酸胺、纯乙醇沉淀。室温孵育5min后，后，4 12000g离心离心10min，70%乙醇洗一次，沉淀物乙醇洗一次，沉淀物枯燥后参与枯燥后参与100l TE缓冲液配成悬液，缓冲液配成悬液，-20保保管。管。3. PCR扩增扩增 PCR扩增反响采用途置过的固化扩增反响采用途置过的固化Taq酶珠，酶珠，反响体系包括模板反响体系包括模板DNA ，选择性引物，选择性引物AFLP-Pst-G：5-GACTGCGT

20、ACATGCAGG-3，dNTP，2.5mmol/L MgCl2。热循环参数为：。热循环参数为：94 1min，60 1min，72 2.5min，循环，循环33次。次。 4. 凝胶电泳凝胶电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压琼脂糖凝胶电泳，电压3.45V/cm，电，电泳泳4h。需在每一个样品电泳带旁加一个分子量。需在每一个样品电泳带旁加一个分子量标志条带。每块胶的第一个样品孔参与来源于标志条带。每块胶的第一个样品孔参与来源于EWGLI规范化分型的规范化分型的Dresden AFLP015型型AFLP产物产物EUL No.。凝胶经。凝胶经EB染色染色30min，紫外光下照相或数字记录。，紫外光下

21、照相或数字记录。5. 数据分析数据分析 将未知型在将未知型在EWGLI建立的军团菌建立的军团菌AFLP型数据库中分析，聚类分析以条带的选择为型数据库中分析，聚类分析以条带的选择为根底，分群分析经过根底，分群分析经过DICE系数和运用平均数系数和运用平均数的非加权成组配对法的非加权成组配对法UDGMA。条带位。条带位置允许误差置允许误差=2%，最优化位置，最优化位置=0.5%。可分。可分析析300bp2500bp的的DNA扩增片段。扩增片段。补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图 影影 响响 因因 素素1. 限制性内切酶限制性内切酶1普通采用双酶切普通采用双酶切2由一个高频

22、内切酶和一个低频内切酶组由一个高频内切酶和一个低频内切酶组成成3普通高普通高G+C摩尔分数的基因组选择摩尔分数的基因组选择识别位点富含识别位点富含G+C的内切酶组合；低的内切酶组合；低G+C摩尔分数的基因组选择识别位点富摩尔分数的基因组选择识别位点富含含AT的内切酶组合的内切酶组合4酶切反响对模板质量要求很高酶切反响对模板质量要求很高5酶切时间酶切时间1 3h6DNA含量普通含量普通0.5g左右，左右，DNA含量不含量不应太高应太高 2. 接头接头 接头是人工合成的一段短核苷酸双链，普通接头是人工合成的一段短核苷酸双链，普通长度是长度是1117个核苷酸，由中心序列和限制酶切个核苷酸，由中心序列

23、和限制酶切特异序列两部分组成。留意接头特异序列两部分组成。留意接头5端为非磷酸化，端为非磷酸化，以防接头间的衔接并保证其只能在以防接头间的衔接并保证其只能在3端与限制性端与限制性片段衔接。片段衔接。 Apa(GGGCC/C)接头的构造接头的构造 5- TCGTAGACTGCGTACA GGCC-3 3- CATCTGACGCATGT-5中心序列中心序列酶切位点酶切位点补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图3. 引物设计引物设计 引物由三部分组成：与接头序列匹配的中心序引物由三部分组成：与接头序列匹配的中心序列，相应的酶切位点和列，相应的酶切位点和3端的选择性碱基。端的选择

24、性碱基。如如Apa 引物：引物： 5-GACTGCGTACA GGCCC NNN-3 中心序列中心序列 Apa切点切点 选择性选择性碱基碱基 重要特征是一切引物重要特征是一切引物5 端是端是G碱基碱基, 可有效可有效防止双链的构成引物。防止双链的构成引物。 设计主要在选择性碱基数目及组合上。选设计主要在选择性碱基数目及组合上。选择性碱基通常为择性碱基通常为13个，对基因组较复杂的生个，对基因组较复杂的生物体在两个引物的物体在两个引物的3端至少有端至少有3个选择性核苷酸个选择性核苷酸才干获得适宜指纹图，而细菌基因组小，普通才干获得适宜指纹图，而细菌基因组小，普通1个选择性核苷酸即足够了。个选择性

25、核苷酸即足够了。补充原理图补充原理图AFLP原理和操作流程图原理和操作流程图GG4. 扩增条件扩增条件 AFLP反响条件与常规反响条件与常规PCR主要不同之处主要不同之处是采用温度梯度是采用温度梯度PCR，即，即PCR始于高温复性始于高温复性普通采用普通采用65，比常规，比常规PCR退火温度高退火温度高10左右以期获得最正确选择性，以后退火温度左右以期获得最正确选择性，以后退火温度逐渐降低每循环降低逐渐降低每循环降低0.7，不断降到最适，不断降到最适退火温度，然后在这个温度下完成其他退火温度，然后在这个温度下完成其他PCR循循环。环。 对于复杂基因，普通采用两步法扩增。对于复杂基因，普通采用两

26、步法扩增。 应应 用用 1. 细菌分型细菌分型 军团菌、大肠杆菌、根瘤土壤杆菌、军团菌、大肠杆菌、根瘤土壤杆菌、表皮葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、黄杆菌属、表皮葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、黄杆菌属、气单胞菌属、梭状杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌气单胞菌属、梭状杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和弧菌属等。属和弧菌属等。 2. 细菌鉴定细菌鉴定 芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽芽孢杆菌属、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、耶尔森菌、孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌等。金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌等。3. 流行病学调查流行病学调查 AFLP

27、AT ESR: TOWARDS AN INTERNATIONAL STANDARDA. butzleriC. coliC. jejuniDNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD) 细菌基因组反复序列细菌基因组反复序列PCR技术技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。三、随机扩增多态性三、随机扩增多态性DNA分析技术分析技术Random Amplified Poly

28、morphism DNA， RAPD 以以PCR技术为背景，以人工合技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机陈列的寡核苷酸成的碱基顺序随机陈列的寡核苷酸单链为引物，对所研讨的基因组单链为引物，对所研讨的基因组DNA进展进展PCR扩增，经电泳分别后扩增，经电泳分别后产生产生DNA指纹图谱。指纹图谱。 基基 本本 原原 理理 模板模板DNA经经9294变性解链后，在较低变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而构成双链构造。假设某两位点的短引物互补而构成双链构造。假设某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条间在可扩增范围之内

29、，且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的单链上，并且与引物的3端相对应，就可以经过端相对应，就可以经过PCR得到一个扩增产物。得到一个扩增产物。基基 本本 原原 理理 RAPD所用的一系列所用的一系列DNA引物序列各不一引物序列各不一样，但对于恣意特定引物，它同基因组样，但对于恣意特定引物，它同基因组DNA序序列有其特定结合位点，假设基因组在这些区域发列有其特定结合位点，假设基因组在这些区域发生片段插入、缺失或碱基突变就能够导致这些特生片段插入、缺失或碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使定结合位点分布发生相应变化，而使PCR产物产物添加、减少或发生分子量改动，产生多态性图

30、谱。添加、减少或发生分子量改动，产生多态性图谱。总总DNA提取提取随机引物合成随机引物合成PCR扩增扩增随机引物挑选随机引物挑选电泳检测电泳检测图谱分析图谱分析根本程序根本程序DNA多态性分析常用的方法多态性分析常用的方法 限制性片段长度多态性分析限制性片段长度多态性分析 (RFLP) 扩增片段长度多态性分析技术扩增片段长度多态性分析技术 (AFLP) 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA分析技术分析技术 (RAPD) 细菌基因组反复序列细菌基因组反复序列PCR技术技术 (rep-PCR) 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 。细菌基因组反复序列细菌基因组反复序列PCR技术技术repet

31、itive-element PCR, rep-PCR 一种基于一种基于PCR的的DNA标志技术标志技术rep-PCR-原理原理 rep-PCR技术是利用基因组中广泛分布技术是利用基因组中广泛分布的短反复序列的短反复序列repetitive sequences)为引物为引物进展进展PCR扩增，经过对扩增，经过对PCR产物的电泳结果产物的电泳结果进展比较，来分析菌株间基因组存在的差别。进展比较，来分析菌株间基因组存在的差别。rep-PCR-短反复序列短反复序列 目前研讨最多、最常用的细菌基因组短反目前研讨最多、最常用的细菌基因组短反复序列有：复序列有：基因外反复回文序列基因外反复回文序列Repet

32、itive Intergenic Palindrome, REP)肠细菌基因间共有反复序列肠细菌基因间共有反复序列Entero-bacterial Repetitive Intergenic Entero-bacterial Repetitive Intergenic Consensus, ERIC)Consensus, ERIC)rep-PCR-短反复序列短反复序列 两者的共同特征是它们在细菌基因组中存两者的共同特征是它们在细菌基因组中存在着菌株、种、属程度上的分布和拷贝数量的在着菌株、种、属程度上的分布和拷贝数量的差别，而序列本身在进化过程中又具有较强的差别，而序列本身在进化过程中又具有较

33、强的保守性。基于这两种短反复序列的保守性。基于这两种短反复序列的PCR就成为就成为rep-PCR的的2个重要的技术个重要的技术 REP-PCR ERIC-PCR两种短反复序列的特点及功能两种短反复序列的特点及功能REP序列序列 基因外反复回文序列REP又称回文单位，其构造特点是回文性质，其转录的mRNA有构成茎-环stem-loop构造的潜能。 REP家族序列由38bp构成，含有6个非常保守的位点及5bp构成的位于非常保守的回文臂之间的保守环。 REP REP家族序列广泛分布在大肠埃希菌和家族序列广泛分布在大肠埃希菌和沙门菌基因组内。沙门菌基因组内。REPREP序列可以单独出现序列可以单独出现

34、或添加为或添加为4 4个串联的反复单位。在个串联的反复单位。在E.coliE.coli的染色体上，存在的染色体上，存在500500到到10001000个的个的REPREP串联串联反复单位，在沙门菌上反复单位，在沙门菌上REPREP串联反复单位串联反复单位约占基因组的约占基因组的1%1%。REP序列的功能：序列的功能：转录终止作用；转录终止作用；稳定稳定mRNA；在体内染色体区段的组织作用在体内染色体区段的组织作用rep-PCR-REP-PCR技术技术 根据根据REPREP这段高度保守的反复序列设计引这段高度保守的反复序列设计引物，扩增两段物，扩增两段REPREP之间的片段，扩增产物的数之间的片段，扩增产物的数量和片段长短的不同就直接反映了基因