磷脂酰肌醇3激酶phosphatidylinositol3kinases催化

1、磷脂酰肌醇-3-激酶家族与急性肺损伤研究新进展华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科（430022）王月兰 姚尚龙 摘要 磷脂酰肌醇-3-激酶以其广泛的分布，参与并产生酯类第二信使，激活细胞内大量酶联级反应，调节多种细胞的生存、激活、分化和繁殖而成为研究细胞信号转导机制的热点。该文重点介绍PI3K结构与功能、激活途径及参与急性肺损伤的机制及其临床意义。关键词 肺损伤 ； 磷脂酰肌醇脂激酶；机制近年来对急性肺损伤（ALI）机制的研究发现，除了目前正在研究的MAPK信号转导通路对ALI影响外，越来越多的试验和临床发现PI3K在急性肺损伤的形成中有着不可忽视的作用。并且还发现PI3K是肺细胞重要的

2、调节酶之一，影响着肺组织的生理和病理变化【1】 。因此对PI3K及其下游底物的研究，可将成为研究和治疗肺部疾病的新靶点。1 PI3Ks结构、功能与生物活性磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases， PI3K）的研究始于1980s后期。近年来对PI3Ks家族的构成、功能研究有了新的突破。PI3Ks 是普遍存在于体内各类细胞，属于酯类的激酶（或酶），能磷酸化与膜相关的磷脂酸肌醇家族，它可以募集和激活下游的靶物质而启动一系列信号联级反应，其在细胞的有丝分裂发生、细胞存活、分化和激活、细胞骨架的构型与重塑以及囊胞的运输起着重要的作用1。1. 1 结构与分类 据其结

3、构、特异底物和不同调节功能PI3Ks可分为三大类2，3。其中PI3-Ks家族已有9个成员从哺乳类生物细胞中分离出来。I类：由P110催化亚基和调配亚基（regulatory adapter subunit）：P50、P55、P85、P101构成的异二聚体，其中P110又有四种亚型分别为：P110、P110、P110和P110。目前已经明确的I类PI3Ks又有两个亚家族，分别为：IA和IB。IA是由p110、p110和p110催化亚单位和调节亚基（P85、P85、P55）构成，对酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase-lingked receptor ）的信号转导系统比较敏感。而IB

4、类只有一种：由P110催化亚基和仅有的P101调节亚基组成。I类PI3Ks在细胞静止无刺激下，主要分布在细胞浆，通常需要由细胞表面受体机械刺激后才能被激活而发挥其特异活性。II类：与I类有4550同源，也有氨基末端区域和同源的C2结构域，可调节钙/磷结合。在体外，II类的PI3K优先磷酸化磷脂酰肌醇（PtdIns）和磷脂酰肌醇4磷酸（PtdIns4P），但在体内的作用尚未明确，目前认为其仅存在于造血细胞。III类PI3Ks是由典型的锚定在VPS34基因的酵母菌蛋白，并且只能磷酸化PtdIns生成PtdIns(3)P，后者被认为可以调节囊胞的运输3。1.2 生物学特性 由于I类的PI3Ks大多数

5、异构体都能感受和传递细胞外刺激，故对其研究较多。与I类PI3Ks偶连的主要受体底物是PtdIns(4，5)P2，二者相互作用可产生最重要的磷脂酰肌醇（3，4，5）三磷酸PtdIns(3，4，5)P3。所有的I类PI3Ks催化亚基都含有一个PI激酶域、一个蛋白激酶域和一个Ras结合域4。最近的结晶学研究表明3PI3Ks的催化域位于分子结构的中心，呈螺旋棘突状，与膜上的磷脂及其相邻的Ras结合域的催化亚基相互作用，然后发挥酶的变构效应。而单体II类PI3Ks的作用底物为 PtdIns(3，4)P2和PtdIns，其在哺乳类中的作用尚不清楚。III类PI3Ks仅用PtdIns作为底物，他们似乎不被细

6、胞表面受体调节，目前试验结果提示其具有看家基因的功能（housekeeping），尤其是在蛋白和囊胞的运输方面。1.3 特异信号转导分子肌醇磷酸脂代谢的调控是细胞信号转导的基础。目前已经明确的肌醇磷脂代谢通路有两个：一 是由磷酸脂酶C（PLCs）水解磷脂酰肌醇（4，5）二磷酸，生成一种可以增加细胞内钙浓度的肌醇1,4,5三磷酸。同时其自身也降解为产生甘油二脂，通过丝/苏氨酸激活蛋白激酶C家族而将信号下传。二是 磷脂酰肌醇3激酶（PI3Ks），可以磷酸化3OH的肌醇磷脂中的肌醇环，生成单磷酸化结构（PtdIns(3)P）、双磷酸化结构（ PtdIns(3，4)P2、和 PtdIns-3,5P2）

7、以及三磷酸化结构PtdIns(3，4，5)P3的形式。然后这些磷脂结合到血小板白细胞C激酶底物蛋白（又叫做普列克底物蛋白）同源的蛋白结构域，并控制其活性以及亚细胞结构内的不同种信号转导分子的定位。其中最主要的调控信号分子有三种：鸟苷酸交换蛋白Rho家族的GTPase、TEC家族的酪氨酸激酶（如存在于T、B淋巴细胞中的BTK和ITK）、AGC超家族丝/苏氨酸蛋白激酶。这些分子存在于不同的细胞，当受到细胞外刺激而激活，并将信号转导细胞内而影响细胞周期的进程、细胞生长、细胞活性以及细胞黏附和细胞生存等5。2 PI3Ks的激活 到目前为止研究发现I类PI3Ks激活有四种方式。I类PI3Ks激活的模型最

8、早是在1994年和1995年分别由kazlauskas6 和Pawson7，对成纤维细胞的受体型酪氨酸激酶研究时建立的。在这一模型中通过P85接头亚基将P110催化亚基募集至活化的酪氨酸激酶受体，在胞浆内的与受体尾端形成复合物，借助P85Src同源2（SH2）域和特异的酪氨酸磷酸化序列之间产生高亲和力，将PI3K 的P110催化亚基募集到细胞膜即可磷酸化其主要底物PtdIns(4，5)P2，生成PtdIns(3，4，5)P3。但也有人发现8PI3K激活也可以通过非受体型的酪氨酸激酶激活，如在白细胞中的JAK细胞信号或Syk、ZAP70，这也说明募集到细胞膜依靠受体的介导并不是必需的。还有许多报

9、道9：P85和其他接头亚基之间的相互作用也能将P110募集到细胞膜，如 由三个接头（three adapters）Shc、Grb、Gab形成的复杂的信号衔接平台(signaling scaffold )，当细胞受到IL-3、IL-2刺激而激活时，利用信号衔接平台之间的相互作用即可将P110催化亚基募集至细胞膜而启动一系列的反应。另外，PI3K 还可以由G蛋白通过对P110的调节而激活。3 PI3s生物学效应机制 PI3Ks之所以有如此多的调控功能，是由于其可以活化各种细胞内的酪氨酸激酶、丝/苏氨酸激酶，以调控各类细胞的生物学过程，见图1。3.1 PI3Ks与酪氨酸激酶 酪氨酸激酶家族成员（IT

10、K、TEC、BTK）的激活需要通过Src激酶在其活性环中进行磷酸化才能完成。ITK、TEC、BTK都有N末端PH域，借助PH域结合于PI3Ks的产物：PtdIns(3，4，5)P3，同时需要Src激酶控制他们和细胞膜之间的连接才能被激活10。缺乏PH域基因则失去BTK激活的条件，可导致严重的疾病。如11在人类酪氨酸激酶PH域基因缺乏，可导致“无球蛋白血症”；而在小鼠体内则患相似的“免疫缺陷症”。当缺乏P85a表型的小鼠则表现为完全缺乏B细胞的功能，而该现象与缺乏BTK鼠的表现十分的一致，由此表明PI3K在B淋巴细胞中的重要性，也再次证明PI3K对BTK起着重要作用。另外，Schaeffer10

11、等在哺乳类细胞内肌醇脂代谢方面的研究如BTK对 PLCr1/2调节和PI3K调控下钙/PKC信号通路的研究，还证实了典型的信号传递之间交叉对话的存在（cross talking），从而提出信号转导是错综复杂、交互影响的。 3.2 PI3Ks与丝/苏氨酸激酶丝/苏氨酸激酶与PI3K相互依存、相互影响而得以激活。其中能使PI3Ks发挥作用关键的丝/苏氨酸激酶就是蛋白激酶B（PKB，或叫做AKT）。PtdIns(3，4)P2和PtdIns(3，4，5)P3均结合于PKB的PH域，然后募集到细胞膜，PI3K得以产生活化效应；而活性的PI3Ks存在又是触发PKB激活的必要因素12，当采用肌醇磷酸酯酶，如

12、SHIP或PTEN抑制PtdIns(3，4，5)P3产生时，则阻滞PKB激活。研究表明13：PKB可以有不同的激活位点，如在细胞膜上，Thr308位被磷酸化；而在C末端（羧基端）疏水区在Ser743位被磷酸化而激活。Thr308位的上游激酶靶物是一个分子量为67kDa、无所不表达的磷脂酰肌醇脂依赖的激酶（PDK1），它在PI3K活性中具有重要作用，它同时也是AGC超家族激酶的调节媒介，能磷酸化PKC异构体的关键活性环和核糖体的S6k和S6k1，见图1。4 PI3K对急性肺损伤的影响和机制研究发现PI3Ks参与或促使急性肺损伤的形成和发展主要是通过参与中性粒细胞的呼吸爆发、调控酪氨酸激酶激活、介

13、导和协助NF-B核转录等方面。进而使得急性肺损伤时，炎性细胞浸润、细胞因子和炎症介质的囤积：IL-1、 IL-2 IL-6、 TNF-、 IL-8、 MIP-2 、黏附因子等加剧肺损伤。4.1 PI3Ks与NF-B激活在静止细胞中NF-KB与其抑制蛋白I-KB家族结合存于胞浆内，I-KB屏蔽NF-B的基因定位序列而处于失活状态，正常细胞也有少量的活性状态NF-B核转录，以维持机体生理机能，当细胞受到TNF、IL-1、病毒、紫外线、内毒素以及巴豆油（phorbol esters ）刺激后，胞浆内的I-kB的32、36位丝氨酸；I-kB的19、23位丝氨酸磷酸化，促使相邻的赖氨酸残基蛋白化，I-k

14、B降解，NF-KB被释放进入核内激活靶基因14。 首先PI3Ks是NF-B依赖的报告基因（NF-B-dependent reporter gene）激活所必需的激酶 。仅有I-kB降解并不完全代表有功能性的NF-B依赖基因的激活。应用基因瞬时共转染方法(transient cotransfection assays)15 验证了PI3K对NF-B依赖报告基因是必需的。而且该试验还证明缺乏P85亚基的HepG细胞，当TNF刺激介导NF-B依赖基因表达80被抑制，这就提示PI3K影响一步或多步骤的NF-B核转导的调节而不是影响它的DNA结合位点。在PI3K激活STAT3的试验研究中也得到同样结果1

15、6。而PI3K抑制剂渥蔓青霉素不能阻断NF-B激活则更进一步说明NF-B激活是由一方面I-KB的降解，另一方面则是具有转导潜力的NF-B（transactivation potential of NF-B）生成增加所致，因此PI3K影响NF-B是多方面的，且与不同的细胞自然行为方式，其影响也不一。再者，最近的资料也表明PI3K/Akt能够导致IkB激酶的磷酸化而激活而增加NF-B的核转录17。4.2 PI3K的异构体PI3K-与LPS诱导的NF-B激活 有报道18当中性粒细胞受到LPS刺激时激活PI3K和Akt，增加NF-B的核集聚并提高依赖NF-B而转录增加的促炎因子的表达。而PI3K抑制剂

16、可减少LPS介到的NF-B激活增加和细胞因子的产生。PI3K-在LPS刺激中性粒细胞导致的NF-B核转录的调节中更加重要。该发现在PI3K基因敲除小鼠后再给予LPS刺激与对照组比较可大大减少NF-B的核集聚。另外，缺乏PI3K的中性粒细胞与LPS一起培养后产生的MIP-2、IL-1、 TNF-a比同样条件下含有所有PI3K异构体的中性粒细胞显著减少18。这一结果证明了PI3K,尤其PI3K在内毒素作用下中性粒细胞激活的过程中起着重要作用。4.3 PI3K与中性粒细胞当肺部炎症或呼吸道疾患时，大量的中性粒细胞即可募集到肺部。其对组织的损伤是因其产生有毒性的氧自由基（一般是由NADPH氧化酶复合物

17、产生），含有高度组织毒性弹性蛋白酶和胶原酶颗粒通过胞吐作用释放出来以及促炎细胞因子释放的增加。研究27表明PI3K主要调节中性粒细胞的激活与募集。如缺乏PI3K的小鼠，中性粒细胞向炎症部位迁移减弱，且含有颗粒的白细胞向肺部的募集也减弱。又如采用TNFa启动的中性粒细胞呼吸爆发活动过程中，超氧化阴离子产生和PtdIns(3,4,5)P3的蓄积大大增加19，说明PtdIns(3,4,5)P3的蓄积与中性粒细胞活性是对应一致的，这种氧化酶和PtdIns(3,4,5)P3之间的相互传递的递质尚不清楚，但足可证明PI3Ks在中性粒细胞呼吸爆发中的作用。另外，通过PtdIns-3,4P2和 PtdIns-

18、3,4,5P3将苏氨酸308和丝氨酸473位点磷酸化，从而激活Akt。而Akt激活是调节中性粒细胞趋化性和呼吸爆发的重要环节。因此，PI3Ks在诱导中性粒细胞趋化作用中有着重要的作用。4.4 嗜酸性粒细胞与中性粒细胞一样，嗜酸性粒细胞只有肺部炎症和疾患时才游走、大量集聚到肺内，如哮喘、嗜酸性粒细胞肺炎等，有毒性的嗜酸性粒细胞蛋白是一种主要的基本蛋白和氧自由基（一般是由NADPH氧化酶复合物产生）损伤气道上皮并产生过敏反应。研究表明这种反应可以被PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002抑制，且对许多化学趋化因子引起的嗜酸性粒细胞趋化性也有抑制作用20。但PI3Ks在嗜酸性粒细胞脱颗粒作用机制尚

19、不清楚。4.5 肺泡的巨噬细胞 虽有关PI3K与肺内巨噬细胞的研究不多，但仍有来自于单核细胞株的巨噬细胞和腹腔的巨噬细胞与PI3K之间的研究报道：在这些细胞的外形反应过程中PI3Ks具有关键性作用。如在无PI3K-（PI3K null）鼠，发现细胞因子诱导的单核细胞趋化性和细胞募集量明显减少21。因此PI3Ks一种或多种亚型是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞的趋化性和肺部募集的重要媒介。尽管在肺部其他细胞中的PI3K作用尚未研究，但其也有着重要的作用，如在胎鼠肺纤维化形成中，PI3K是PDGF刺激合成葡萄糖胺聚糖的下游介质，提示PI3K在细胞外基质稳定中的作用 。也有报道22PI3K介导肺上

20、皮细胞的分化，介导肺纤维化的表面物质表达。并且还发现PI3K通过影响肺气管平滑肌收缩和嗜酸性粒细胞募集而调控哮喘的发作；因此，目前认为当肺部炎症发作时，PI3Ks通过调节机体内环境的“损害与保护”两方面的平衡以及对肺感染时粒细胞的募集、激活、凋亡等调控来发挥作用的。 总之，不论在正常肺细胞生理功能或是肺部疾患时，PI3K对肺组织的生理和病理过程有着重要的作用，影响着肺内多种细胞的行为。尤其PI3Ks家族不同亚基或不同异构体，通过不同途径对急性肺损伤影响的研究新的突破，可望成为研究和治疗肺部疾病的新靶点。图1 PI3Ks作用机制参考文献1 .Coelho C. M, Leevers S. J.

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