高效液相色谱法

1、高效液相色谱法高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在经典液相色）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以压技术，以高压输送流动相高压输送流动相，采用，采用高效固定高效固定相相及及高灵敏度检测器高灵敏度检测器，发展而成的现代液相，发展而成的现代液相色谱色谱分离分析分离分析方法。方法。概述概述 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是以是以溶剂液体为流动相溶剂液体为流动相的色谱方法。的色谱方法。 早期液相色谱，包括早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径的工作，

2、都是在直径1-5cm, 长长50-500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在定相颗粒直径多在150-200 m范围内。即使这样，流速仍然很范围内。即使这样，流速仍然很低低(1mL/min)，分析时间仍然很长！分析时间仍然很长！ 当加压增加流速当加压增加流速(真空或空气泵真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地最为

3、有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（310 m ）！）！ 直到直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。液相色谱流程液相色谱流程图图PUMPDetectorWData station (Recorder) or CollectionColumnMobile phase气相色谱流程图气

4、相色谱流程图DetectorCarrier gasFlow or pressurecontrollerInjection port or valveColumnData station (Recorder)W四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 l分配色谱法（分配色谱法（partition chromatography），利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 l吸附色谱法（吸附色谱法（adsorption chromatography），），基于在溶

5、质和用作固定相吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用。四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 l离子交换色谱法（离子交换色谱法（IEC），），固定相是一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子。这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 l空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SEC），），固定相为化学惰性多孔物质

6、凝胶，凝胶具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。正相色谱（反相色谱）正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作流动相，即流动相的极性固定相的极性。正相色谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱，极性大的后出柱。（反之为反相色谱）进样器馏分收集器记录仪检测器一一 高压输液系统高压输液系统1.贮液器：贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金合金)，其孔径约，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行，可防止颗粒物进行泵内。泵

7、内。2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。体透过膜从溶剂中除去。3.高压泵：高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵恒压泵(类似于风箱类似于风箱)可迅速获得高压，适于可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统动

8、时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每见下图。每分钟往复分钟往复25100次，因此脉动小。对流量变次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器接一脉动阻尼器)。4.梯度淋洗装置梯度淋洗装置如果只有一个泵，可采用低

9、压混合设计如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。调节各自的流量，在高压下混合。分离和进样系统分离和进样系统 （一）进样系统（一）进样系统 与与GC相比，相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器因素包括：进样系统、连接管道及检测器

10、的死体积。进样装置包括两种。的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。差。2. 高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。重复性好，如图。（二）（二） 色谱柱色谱柱由柱管与固定相组成，柱管多用不锈钢制成，由柱管与固定相组成，柱管多用不锈钢制成，管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀管内壁要求具有很高的光洁度。固定相采用匀浆法高压（浆

11、法高压（80 100MPa）装柱。）装柱。色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类分析型柱分析型柱 常量柱：内径常量柱：内径24.6mm，柱长，柱长10 25cm。半微量柱：内径半微量柱：内径1 1.5mm，柱长，柱长10 20cm实验室制备型柱：内径实验室制备型柱：内径20 40mm，柱长，柱长1030cm 常用色谱柱柱效评价条件如下：常用色谱柱柱效评价条件如下：硅胶柱硅胶柱 样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）；样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）；流动相：无水己烷。流动相：无水己烷。反相色谱柱反相色谱柱（ODS柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、柱等）样

12、品：尿嘧啶（测死时间用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）；硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）；流动相：甲醇流动相：甲醇水（水（85：15） 乙腈乙腈水（水（60：4O）。）。正相色谱柱（氰基与氨基柱等）正相色谱柱（氰基与氨基柱等）样品： 四氯乙烯（测死时间用）、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇。也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯为样品；流动相：正庚烷 按上述条件，测得各组分的W1/2。及tR，求出理论塔板数n及相邻组分的分离度R（l5）。 色谱柱柱效指标色谱柱柱效指标 填料粒径为填料粒径为3m、4m、5m 、7m或或10m时，柱效应分别大于时，柱效应分别大于8万、万、

13、6万、万、5万、万、4万及万及 25万理论塔板数米（或用万理论塔板数米（或用 m1表示表示）。）。 色谱柱的再生色谱柱的再生 反相色谱柱反相色谱柱 以甲醇一水（以甲醇一水（95：5）、纯甲）、纯甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应不得颠倒。每种流动相的冲洗体积应20倍于倍于柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。柱体积。然后，再以相反顺序依次冲洗。 正相色谱柱（含硅胶柱）正相色谱柱（含硅胶柱）以严格脱水的正以严格脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步

14、骤同上。依次冲洗，顺序不得颠倒。其它步骤同上。 三、检测系统三、检测系统 要求：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重要求：灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重复性好、适用性广等。复性好、适用性广等。 应用最多的是紫外检测器（应用最多的是紫外检测器（UVD）。其次）。其次是荧光检测器（是荧光检测器（FD）与电化学检测器（）与电化学检测器（ECD）。示差折光检测器（）。示差折光检测器（RID）虽是泛用型检测）虽是泛用型检测器，因受温度影响较大，灵敏度不够高，除还器，因受温度影响较大，灵敏度不够高，除还用于糖类的检测外，已少用。用于糖类的检测外，已少用。 新型蒸发光散射检测器及发光检测器是有发新型蒸发光散射

15、检测器及发光检测器是有发展前途的检测器。展前途的检测器。（一）紫外检测器（一）紫外检测器（UVD或或UV）HPLC分析中因此该类检测器应用很广。分析中因此该类检测器应用很广。原理原理 样品组分通过流通池时对特定波长紫样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收与浓度成正比。外线的吸收与浓度成正比。检测系统检测系统 由光源、流通池、检测元件、微由光源、流通池、检测元件、微机及记录器等组成。机及记录器等组成。 常用纯溶剂的截止波长：水常用纯溶剂的截止波长：水190、乙腈、乙腈190、甲醇甲醇205、正己烷、正己烷210、乙醚、乙醚220、四氢呋喃、四氢呋喃225、二氯甲烷、二氯甲烷245、氯仿、氯仿

16、245nm。 在选择测量波长时注意在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长（最低使用波长（截止波长截止波长）。特点特点 灵敏度高灵敏度高,噪音低，最小检出量可达噪音低，最小检出量可达10-12g 不破坏样品，能与其它检测器串联。不破坏样品，能与其它检测器串联。 对温度及流速波动不敏感，可用于梯度淋对温度及流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。洗。 属浓度型检测器。属浓度型检测器。弱点弱点 只能检测有紫外吸收的样品；只能检测有紫外吸收的样品； 流动相的选择有一定限制。流动相的选择有一定限制。紫外吸收检测

17、器的类型紫外吸收检测器的类型 分为：固定波长型、可变波长型及二极分为：固定波长型、可变波长型及二极管阵列检测器三种。管阵列检测器三种。1.固定波长检测器固定波长检测器 是光源波长固定的光度计，一般波长为是光源波长固定的光度计，一般波长为254nm，相当于定波长紫外光度计。因波，相当于定波长紫外光度计。因波长不能调节，不能选择在最佳吸收波长下长不能调节，不能选择在最佳吸收波长下检测，检测，已基本淘汰已基本淘汰。 2可变波长型检测器可变波长型检测器 是一台紫外是一台紫外可见分光光度计或紫外分可见分光光度计或紫外分光光度计，波长可按需要选择。是光光度计，波长可按需要选择。是HPLC配置配置最多的检测

18、器。其光学结构与一般紫外分光光最多的检测器。其光学结构与一般紫外分光光度计一致，主要区别是用流通池替代了比色池。度计一致，主要区别是用流通池替代了比色池。通常其光程为通常其光程为210mm, 体积约为体积约为110 L。 3.光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（PDAD） 是是80年代出现的新型紫外检测器。人们想测年代出现的新型紫外检测器。人们想测定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息。定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息。但因组分停留时间太短但因组分停留时间太短(1秒秒)，普通紫外分，普通紫外分光光度计的扫描速度跟不上，若停留扫描则破光光度计的扫描速度跟不上，若停留扫描则破坏了分离

19、状态。而二极管阵列检测器用坏了分离状态。而二极管阵列检测器用二极管二极管阵列代替光电管阵列代替光电管，一般一个二极管对应接受光，一般一个二极管对应接受光谱上一个纳米（谱上一个纳米（nm）谱带宽度的单色光。可）谱带宽度的单色光。可在全波长范围进行快速扫描，在全波长范围进行快速扫描，获得三维光谱一获得三维光谱一色谱图，同时得到定性、定量信息。色谱图，同时得到定性、定量信息。（二）荧光检测器（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光光度计，已基本淘汰。光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池目前使用的荧光检测器多是具有流通池的荧光分

20、光光度计（直角光路）。的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达检测限可达1 10-10gml，比紫外检测，比紫外检测器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。物能发荧光的物质。 主要用于氨基酸、主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、多环芳烃、维生素、甾体化合物、酶类、甾体化合物、酶类、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药等的等的检测。检测。 （三）蒸发光散射、化学发光及安培检测器（三）蒸发光散射、化学发光及安培检测器 1蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（ELSD） 是90年代出现的最新型的泛用检测器。可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测，主要用于糖

21、类、高分子化合物、高级脂肪酸及甾体类等。还可用于凝胶色谱及超临界流体色谱的检测。 原理：原理： 将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气（高纯N2）的蒸发室，加热，使流动相蒸发除去。组分则形成气溶胶，被载气带入检测室，用激光或强光照射气溶胶而产生散射光（丁锋尔光效应），测定散射光强而获得组分的浓度信号。散射光强I与进入检测器的气溶胶中组分质点的“质量和”m的关系为： Ikmb k、b是二个与实验条件有关的常数2化学发光检测器化学发光检测器 是近年发展起来的高选择性、高灵敏度是近年发展起来的高选择性、高灵敏度的新型检测器。设备简单，自身发光不需的新型检测器。设备简单，自身发光不需光源，价格便宜，可

22、自制，很有发展前途。光源，价格便宜，可自制，很有发展前途。化学发光反应常用酶为催化剂，将酶标记化学发光反应常用酶为催化剂，将酶标记在待测物、抗原或抗体上，可进行药物代在待测物、抗原或抗体上，可进行药物代谢分析及免疫发光分析。谢分析及免疫发光分析。 检测原理检测原理 某些物质在常温下与发光试剂反应，生成处某些物质在常温下与发光试剂反应，生成处于激发态的产物，当它们由激发态返回基态时于激发态的产物，当它们由激发态返回基态时发射光子。因其能量来源于化学反应，故称为发射光子。因其能量来源于化学反应，故称为化学发光。光强与组分浓度成正比。最小检测化学发光。光强与组分浓度成正比。最小检测量可达量可达pg级

23、（级（1012g）。）。3安培检测器（安培检测器（AD） 电化学检测器包括电化学检测器包括电导检测器、安培检测电导检测器、安培检测器及极谱检测器等。电导检测器主要用于离器及极谱检测器等。电导检测器主要用于离子色谱，安培检测器与极谱检测器可用于可子色谱，安培检测器与极谱检测器可用于可氧化、还原的物质的检测。氧化、还原的物质的检测。 其它其它 尚有红外检测器、介电常数检测器及尚有红外检测器、介电常数检测器及放射性检测器等。放射性检测器等。 高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法一、定性分析方法一、定性分析方法 HPLC的定性方法与的定性方法与GC相似，可分为色谱相似，可分为色谱鉴定法及非色谱鉴定法两类。鉴定法及非色谱鉴定法两类。 1色谱鉴定法色谱鉴定法 保留时间或相对保留时间保留时间或相对保留时间对照。对照。 2化学鉴定法化学鉴定法 分离后收集组分定性。分离后收集组分定性。 3 3两谱联用鉴定法两谱联用鉴定法 （1 1）两谱联用法：）两谱联用法：用用 HPLC HPLC制备纯组分，制备纯组分，用光谱仪器鉴定。用光谱仪器鉴定。 （2 2）两谱联用仪：）两谱联用仪：能同时获得定性、定能同时获得定性、定量信息。如量信息。如HPLC