IPTG诱导外源基因表达

1、IPTG诱导表达原理及操作步骤E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖甘酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP结合位点。由P序列、O序列和CAPS合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转

2、录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b-半乳糖音酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。材料1、诱导表达材料(1)LB(Luria-Bertani)培养基酵母膏(Yeastextract)5g蛋白陈(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%蒸储水(Distilledwater)1000mlpH7.0适用范围：大肠杆菌(2)

3、IPTG贮备液2gIPTG溶于10mL蒸储水中，0.22m滤膜过滤除菌，分装成1mL/份,-20C保存。(3)lX凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%澳酚蓝10%甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1)酶溶法(1)裂解缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH8.0)(1) mmol/LEDTA100mmol/LNaCI(2) 50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF。(3) 10mg/mL溶菌酶。(4) 脱氧胆酸。(5) 1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1)TE缓冲液。(2)2XSDS-PAGE凝胶

4、电泳加样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%澳酚蓝20%甘油实验方案1、外源基因的诱导表达(1)用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2)按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。(3)筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，确定无误后进行下一步。(4)如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32C培养数小时，使培养液的OD600&0.4-0.6,迅速使温度升至42C继续培养3-5h;如果表达载体的原核启动子为tac等，则37c培养细菌数小时达到对数生长

5、期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。(5)取上述培养液1mL,1000g离心，1min，沉淀，力口100L聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS-PAGE检测。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1)细菌的裂解常用方法有：高温珠磨法；高压匀浆；超声破碎法；酶溶法；化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法、已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；3-1,3-葡聚糖酶；P-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要

6、步骤为：4,5000rpm离心，15min,收集诱导表达的细菌培养液(100mL。弃上清，约每克湿菌加3mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。目的蛋白的诱导表达和纯化(1)菌在含氨苇青霉素(100m0L)的LB培养基中37c振摇培养过夜(2)按10%勺接种量转接入新鲜LB培养基，250rpm37C摇菌至乐。二1加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L,37c继续通气培养45h分别于2h、4h各取1.5mL菌液，7734g离心30s收集菌体菌体加入H2O60pL,剧烈振荡混匀，再加入4X样品缓冲液20L,100C,5min;7734g离心5min;(6)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色后观察诱导

7、结果(7)大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，离心，收集菌体，将菌体重悬于lysisbuffer,超声破菌(8)离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化.以包涵体形式存在的表达产物.用N十二烷基肌氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜，经缓慢透析去除N十二烷基肌氨酸钠，令蛋白复性后，用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析纯化(10)先以510个柱体积(CV)PBSg冲液平衡柱，流速1.5ml/min;样品液10ml上样，流速为0.5ml/min,用510CV缓冲液洗脱未结合的物质；5CV的洗脱液洗脱目标蛋白，流速1.5ml/min

8、,收集洗脱液。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物，检测表达产物的分子量及纯化效果。重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化将阳性重组质粒转化至BL21中，选取多个重组菌落接种LB液体培养基中37c振摇培养过夜，按1：100比例转入新鲜LB培养基，培养至OD值为1.0时，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG继续诱导培养3h。离心，收集菌体。将诱导后的菌体重悬于lysisbuffer,超声破碎后离心去沉淀，收集样品液。GSTrapFF柱亲和层析纯化重组蛋白。先以510个柱体积(CV)PBS缓冲液平衡柱，流速1.5ml/min;样品液10ml上样，流速为0.5ml/min,用510CVS冲液洗脱未结合

9、的物质；5CV的洗脱液洗月目标蛋白，流速1.5ml/min,收集洗脱液。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物，检测表达产物的分子量及纯化效果。铺板培养12h后挑取阳性克隆，37C、300Xg培养至菌液A260=0.6时，力口入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)诱导蛋白表达。分别于2h、4h各取菌液100pL,离心收集细菌沉淀，行SDS-PAG电泳，考马斯亮蓝染色后观察诱导结果。大量菌液37C1mmol/LIPTG诱导表达4h后回收细菌沉淀。将诱导的蛋白用纯化包涵体的方法进行初步纯化，然后进行SDS-PAG由泳，回收包涵体.将切下的目的蛋白条带用电洗脱方法

10、回收。GST亲和层析原理谷胱甘肽转硫酶(GlutathionS-transferases,简称GSTs,EC2.5.1.18)广泛存在于动物和人体的各种组织，是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同功酶，分子量为23-29KD。GST蛋白能与亲和介质上的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和，再用还原性谷胱甘肽竞争GST上的结合位点将GST蛋白洗脱下来，从而达到纯化的目的。1ml树脂大约可结合5-8mg融合蛋白，并可反复使用数次。试齐IIPTG(异丙基硫代-&D-半乳糖昔)：2gIPTG溶解入10ml水，过滤除菌，分装，-20C保存。Lysisbuffer(50ml)1)2.5ml1MTr

11、is,pH8.02）0.1ml0.5mlEDTA3）0.292gNaCl4）0.5mlTritonX-1005）0.25ml1MDTTuElutionbuffer1）0.615gglutathione2）10ml1MTris,pH8.03）90mldistilledwater.操作步骤1）挑一个克隆至2mlLB液中（Amp+）2）37C振摇至OD600值约为0.63）将2ml菌液加入100mlLB中4）37C振摇至OD600值约为0.65）加入IPTG至终浓度为1mM6）继续摇34h7）离心（5000rpm,5min,4C）8）用10册体积的lysisbuffer悬浮细菌9）超声破碎细胞10）离心（12,000rpm,15min,4C）,取上清11）用滤纸过滤12）力口0.5ml50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱13）5型体积的lysisbuffer洗层析柱14）样品过柱15）5型体积的lysisbuffer洗层析柱16）3型体积的elutionbuffer洗脱蛋白17）收集蛋白：0.5ml/