(农业大学)生物化学(6)

1、1第三章、核酸（nucleic acid）2本章内容提要：n第一节、核酸的发现与研究简史n第二节、核酸的种类、分布及功能n第三节、核酸的组成、结构n第四节、核酸的理化性质n第五节、核酸的研究方法3第一节、核酸的发现与研究简史n1868年，瑞士的外科医生Friedrich Miescher从脓细胞中发现了DNA。n1944 年， O. Avery 通过肺炎双球菌转化实验证明DNA是遗传物质n1953年， Watson-Crick提出DNA双螺旋结构模型，为分子生物学的发展史奠定了基础。n2000年，人类基因组计划（HGP）基本完成：返回4肺炎双球菌转化试验研究对象：肺炎双球菌SIII型菌株：有荚

2、膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性56Watson-Crick的DNA双螺旋结构模型7人类基因组计划（HGP）：n1986年，著名生物学家H.Dulbecco在Science杂志率先提出；完成人类基因组DNA全序列测定；是生物学有史以来最巨大和意义深远的一项科学工程；将有益于人类健康、医疗、制药、人口、环境等方面，对生命科学也有极大贡献。n人类细胞有23对染色体，单倍体基因组大约有3109碱基对8第二节、核酸的种类、分布及功能一、核酸的种类n脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid， RN

3、A）两大类。9nDNA：含有D-2-脱氧核糖和胸腺嘧啶；通常为双链结构，使DNA分子稳定；是主要的遗传物质，通过复制而将遗传信息由亲代传给子代。nRNA：含有D-核糖和尿嘧啶；通常为单链结构（某些病毒为双链RNA）；与遗传信息的表达有关。10、DNA的种类n1、线型双链DNA：真核生物染色体DNA、某些病毒DNA 。n2、环状双链DNA：原核生物染色体DNA、质粒DNA、真核生物细胞器DNA、某些病毒DNA 。n3、线型单链DNA：某些病毒DNA，如：小鼠微小病毒n4、环状单链DNA：某些病毒DNA，如：丝杆噬菌体fd11n质粒（plasmid）：细菌中的染色体外的遗传成分；为环状双链DNA分

4、子；为重组DNA技术中的有用工具。12、RNA的种类1、信使RNA （ mRNA）n占细胞总RNA的3%5%左右，含量最少；代谢活跃。在蛋白质的生物合成中起模板作用。2、转移RNA (tRNA) n占细胞总RNA的15%左右；细胞中最小的一种RNA分子。在蛋白质的生物合成中起携带氨基酸和解译的作用。133、核糖体RNA (ribosome RNA ，rRNA) n占细胞中总RNA80%左右，含量最大 。在蛋白质合成中起催化作用，催化肽键的形成（可以说，核糖体是一种核酶，蛋白质只是维持rRNA构象）。原核细胞中rRNA有三种，分别是：16SrRNA（小亚基），23SrRNA、5SrRNA（大亚基

5、） ；高等真核细胞中rRNA有四种，分别是： 18SrRNA （小亚基）， 28SrRNA、5.8SrRNA、5SrRNA （大亚基） 。14二、核酸的分布n1、DNA的分布n核（ 98 %） ；浆（ 2 %）n原核细胞：核区；细胞质n真核细胞：细胞核；线粒体、叶绿体等细胞器n2、RNA的分布n核（%） 90n3、病毒或只含DNA，或只含RNA。15三、核酸的生物功能1、是主要的遗传物质2、RNA功能的多样性n控制蛋白质合成；n作用于RNA转录后加工与修饰；n基因表达与细胞功能的调控；n催化作用；n遗传信息的加工与进化；n在RNA病毒中是遗传信息的一级载体返回16第三节、核酸的组成、结构171

6、8一、核苷酸n包括核糖核苷酸（ RNA的结构单位）和脱氧核糖核苷酸（ DNA的结构单位）n细胞内还有各种游离的核苷酸和核苷酸衍生物，它们有重要的生理功能。n如：FAD、CoA、NAD+、NADP+、腺苷钴胺素19（一）碱基（base）1、嘧啶碱(pyrimidine base)n嘧啶的衍生物。n核酸中常见的嘧啶：胞嘧啶(cytosine,C) 、尿嘧啶(uracil,U) （ RNA ）、胸腺嘧啶(thymine,T) （ DNA ）。n胸腺嘧啶在tRNA中也有少量存在。2、嘌呤碱(purine base)n嘌呤的衍生物。n核酸中常见的嘌呤：鸟嘌呤(guanine,G)、腺嘌呤(adenine

7、,A)202-氧,4-氨基嘧啶5-甲基尿嘧啶2,4-二氧嘧啶6-氨基嘌呤2-氨基,6-氧嘌呤21n核酸中五种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可以发生酮式一烯醇式或氨基、亚氨基之间的结构互变，书写时用任何一种皆可。n这种互变异构在基因的突变和生物的进化中具有重要作用 。223、稀有碱基（minorbase）（1）稀有碱基：又称修饰碱基（modified base），稀有的微量碱基衍生物。（2）稀有碱基种类极多，大多数都是甲基化（m）碱基。n修饰基团在碱基上的写在碱基符号左边，修饰基团在核糖上的写在碱基符号右边，修饰基团的位置写在右上角，数目写在右下角。（3）稀有碱基在各种类型核酸

8、中的分布不均一，在tRNA中含量较高（可高达10%）2324（二）核苷n1.核苷：由戊糖与碱基以糖苷键连接而成，是一种糖苷。n2.通常是戊糖的C1与嘧啶碱的N1或嘌呤碱的N9相连接。糖苷键为CN键，为N-糖苷键（核酸中均为-糖苷键）。n3.包括核糖核苷和脱氧核糖核苷。25n4.糖环中的碳原子标号右上角加撇，而碱基中原子的标号不加撇。n5、稀有核苷包括修饰核苷和异构化核苷。n核糖也能被修饰，主要是甲基化；n稀有核苷主要在RNA中；n假尿苷：核糖的C1与尿嘧啶的C5相连。26（三）核苷酸1.核糖核苷的糖环上有3个自由羟基，能形成3种不同的核苷酸；n脱氧核糖核苷的糖环上有2个自由羟基，只能形成2种不

9、同的核苷酸；n生物体内游离存在的核苷酸多是5-核苷酸。n用碱水解RNA时，可得到2-核糖核苷酸与3-核糖核苷酸的混合物。272.多磷酸核苷酸n种类： 5-二磷酸核苷（ 5- NDP）、 5 -三磷酸核苷（ 5- NTP）n功能：核酸合成的前体；重要的辅酶和能量载体。2829303、环化核苷酸n重要的有：cAMP、cGMP。n功能：细胞功能的调节因子和信号分子。31cAMP的产生32二、核酸的共价结构n核酸的共价结构：即核酸的一级结构，指核酸的核苷酸序列。（一）核酸中核苷酸的连接方式n3,5磷酸二酯键n书写顺序：5 333n核酸共价结构的表示方法：n竖线式表达法：用竖线代表戊糖，字母代表碱基；P

10、代表磷酸基团n文字表示法：P在碱基左侧，表示P在C5位置上， P在碱基右侧，表示P与C3相连，书写顺序5 3。5pCpApG334(二)DNA的一级结构nDNA的一级结构：构成DNA的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序，通过3,5磷酸二酯键相连形成的线形结构。也称为碱基的排列顺序。35（三）RNA的一级结构1、tRNA的一级结构n3端皆为CpCpAOH。362、mRNA的一级结构（1）原核细胞：多顺反子（cistron），即一条mRNA链上有多个编码区，5端和3端各有一段非翻译区（untranslated region，UTR）n顺反子：基因功能的单位；编码一条多肽链的一段染色体；一种结构基因。37

11、（2）真核生物的mRNA的结构特点单顺反子。 5端有帽子结构：由甲基化鸟苷经焦磷酸与mRNA的的5末端核苷酸相连，形成5，5-三磷酸连接。（图）n三种类型：m7G5PPP5Np； m7G5PPP5NmpNp； m7G5PPP5NmpNmpNp三种。n作用：抗5核酸外切酶的降解作用；在蛋白质合成过程中，有助于核糖体对mRNA的识别与结合，使翻译得以正确起始。 3端有poly（A）：3端大约20250的聚腺苷酸，可能与mRNA从细胞核到细胞质的运输有关。38甲基鸟苷5，5-三磷酸 5-帽子：m7G 5 -ppp5-Nm（ Nm ）p-3940三、DNA的高级结构（一） Chargaff规则n关于D

12、NA碱基组成的规律，包括：n1.A=T；n2.G=C；n3.含氨基的碱基（A+C）=含酮基的碱基（G+T）n4.A+G=C+Tn暗示了A与T， G与C相互配对的可能性。nDNA碱基组成具有生物种的特异性。41（二）DNA的二级结构1、双螺旋结构模型-Watson-Crick，1953：n两条平行多脱氧核苷链以相反方向围绕同一轴盘绕；两条链都是右手螺旋（图）。n两条链配对偏向一侧，形成一条大沟和一条小沟（图） 。n碱基在螺旋内，其平面与中心轴垂直；磷酸与核糖在外，由3，5-磷酸二酯键连接，糖环平面与中心轴平行（图）。n螺旋平均直径为2nm，碱基对的堆积距离为0.34nm，每10个核苷酸形成螺旋的

13、一转（图）。n两条链由碱基对之间的氢键相连，在空间上可能的碱基对只有A与T（两个氢键）以及G与C（三个氢键）（图） 。42434445462、其他nDNA能以多种不同的构象存在。n1.B-DNA：Watson-Crick双螺旋，比较接近细胞正常状态下DNA存在的构象。n2. A-DNA：比较粗短，碱基倾角大一些，大沟深度明显超过小沟。n3. Z-DNA：细长，大沟平坦，磷酸和糖骨架呈Z字型；左手DNA螺旋。（图）nDNA的变构效应可能与基因表达的调节有关。4748493、特殊的DNA二级结构(1) 回文结构n回文结构也称反向重复（inverted repeats）50(2) 发夹形和十字形51

14、(3) H-DNA-三链螺旋524、维持DNA二级结构的作用力n氢键n虽然它只是一种作用较弱的次级键，但当DNA分子中氢键数量众多，仍可产生足够的能量来维持DNA分子结构稳定性。n碱基堆积力n碱基堆积力实质是疏水相互作用和范德华力。它对维持DNA的二级结构起主要作用。53（三） DNA的三级结构n1、DNA三级结构： DNA分子（双螺旋）通过扭曲和折叠所形成的特定构象。n2.超螺旋(superhelix) ：环状双链DNA或两端固定的线形双链DNA进一步缠绕时形成的结构； DNA三级结构的一种形式；具有更致密的结构。54n负超螺旋（negative superhelix） ：向DNA双螺旋的相

15、反方向缠绕而成的超螺旋，又称松弛缠绕；天然的超螺旋DNA均为负超螺旋；可使其二级结构处于松散状态，使分子内部张力减少，利于DNA复制、转录和基因重组。n正超螺旋（positive superhelix） ：向DNA双螺旋的相同方向缠绕而成的超螺旋，又称紧密缠绕；使分子内部张力加大，旋得更紧。55（四）DNA与蛋白质复合物的结构n生物体内的核酸通常都与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白的形式存在。如：病毒、真核生物的染色体。56真核生物染色体的结构n基本单位核小体（nucleosome):由DNA和组蛋白核心构成；n组蛋白：H2A、H2B、H3、H4、 H1n核心由H2A、H2B、H3、H4各两个组

16、成八聚体；nDNA以左手螺旋在组蛋白核心上盘绕1.8圈，共146bp，n核小体之间有连接DNA和组蛋白H1连接呈串珠状结构。（图）5758四、RNA的高级结构nRNA通常是单链线形分子，但可自身回折形成局部双螺旋（二级结构），进而折叠（三级结构）。除tRNA外，几乎所有RNA都与蛋白质形成核蛋白复合物（四级结构）nRNA二级结构：单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋的多“茎”多“环”结构。螺旋部分称为“茎”或“臂”；非螺旋部分称为“环”；在螺旋区，A与U配对，G与C配对。（图）5960（一）tRNA的高级结构1、tRNA的二级结构（1）形状：三叶草形。（2）组成：4臂4环组成n4臂：氨基酸接受臂、

17、反密码臂、二氢尿嘧啶臂、TC臂。n4环：反密码环（次黄嘌呤I核苷酸常出现于反密码子中）、二氢尿嘧啶环、TC环和额外环（大小不同， tRNA分类的重要指标）（图）6162n（1）氨基酸臂：由7对碱基组成，富含鸟嘌呤，末端为CCA，接受活化的氨基酸。n（2）二氢尿嘧啶环：由812个核苷酸组成，具有两个二氢尿嘧啶，故得名。n（3）反密码环：由7个核苷酸组成。环中部为反密码子，由3个碱基组成。次黄嘌呤核苷酸（I）常出现于反密码环中。n（4）额外环：有318个核苷酸组成。不同的tRNA有不同大小的额外环，故可作为tRNA分类指标。n（5）TC环：由7个核苷酸组成。几乎所有tRNA在此环中都含有TC。63

18、2、tRNA的三级结构n倒“L”形，所有的tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似的三级结构。 64（二）rRNA的高级结构大肠杆菌16SrRNA和5SrRNA的二级结构返回65第四节、核酸的理化性质一、核酸的水解（一）核酸的酸解n糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解；66 n糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解；n嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定；n对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。如：nDNA在pH1.6于37对水透析，可完全除去嘌呤碱，得到无嘌呤酸（apurinic acid）。67（二）碱水解n1、RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。n原因： RNA的核糖上有2-OH羟基，在碱

19、作用下形成磷酸三酯；磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2，3-环磷酸酯；环磷酸酯继续水解，产生2-核苷酸和3-核苷酸。（图）n2、 DNA的磷酸酯键不易被碱水解， DNA一般对碱稳定。6869（三）酶水解1、水解核酸的酶（1）磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键的酶。n催化寡核苷酸及多核苷酸中双重酯化的磷酸分子进行水解的酶类。如：3，5-cAMP磷酸二酯酶。（2）核酸酶（nuclease）：专一水解核酸的磷酸二酯酶。702、核酸酶的分类（1）按照对底物作用的方式n核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease）（2）按照磷酸二酯键断裂的方式n在3-羟基与磷酸基之间断

20、裂n在5-羟基与磷酸基之间断裂71（3）按照底物专一性n核糖核酸酶（RNase）和脱氧核糖核酸酶（DNase）723、限制性内切酶n限制性内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶（restriction enzyme）；存在于原核生物中；催化对外源DNA的降解；识别DNA中特异的碱基序列，将DNA分子剪切为数量不多的片段（限制性片段）；为基因工程最重要的工具酶。73n限制性内切酶的特征 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 粘性未端，平整末端74举例: 75二、核酸的酸碱性质n核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质，为两性电解质。

21、n核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。76三、核酸的紫外吸收（一）核酸的紫外吸收特性n嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。77（二）核酸的紫外吸收特性的应用1. 作为定量测定核酸的方法。2. 鉴定核酸样品的纯度。A260/A280比值：纯DNA=1.8；纯RNA=2.0；样品中含有杂蛋白， A260/A280比值明显降低。3.可判断核酸是否发生变性或降解。增色效应（hyperchromic effect）：当核酸

22、变性或降解时，其紫外线吸收强度显著增高减色效应（hypochromic effect）：变性的核酸在一定条件下恢复原有性质时，其紫外线吸收强度又可回复到原有水平。n双螺旋结构使碱基对的电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。78四、核酸的变性、复性和杂交（一）核酸的变性(denaturation)1、核酸的变性：核酸双链螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键的断裂。n与核酸的降解区别开。2、引起核酸变性的因素n加热、强酸、强碱、有机试剂（尿素、甲醛、甲醇、乙醇、甲酰胺等）或射线等一切可以破坏核酸分子氢键的处理，都可使核酸变性。3、变性DNA的特征n紫外吸收增强；粘度降低；浮力密度升高；比旋下降

23、；生物功能减小或消失等。794、DNA的热变性nDNA热变性是在一个很窄的温度范围内发生的。nDNA的融解温度(Tm)：或称熔点，在核酸加热变性过程中，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏时的温度，又称为核酸的解链温度。（即在260nm下光吸收达到最大光吸收一半是的温度）nDNA的Tm值一般在8295之间。80n与Tm值有关的因素n GC所占总碱基数的百分比成正相关n经验公式： Tm=69.30.41(G+C)%n或（G+C）%=（ Tm-69.3）2.44n离子强度n溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽。因此，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 n均一性n均质DNA：热变性

24、温度范围较小；n异质DNA：热变性温度范围较宽。815. RNA的变性n转变不如DNA明显，随着温度的升高， RNA 中双链部分的碱基堆积会逐渐减少，吸光值逐渐地、不规则地增大； nTm值较低。82（二）核酸的复性1、DNA的复性：变性因素解除后，因变性而分开的DNA两条单链即可再聚合成原来的双螺旋，其原有的性质，可得到部分恢复。832、DNA的复性主要制约因素（1）降温速度n复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温，复性几乎是不可能的。n退火(annealing)：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为。（2）DNA浓度浓度较高时，易于复性。（3）DNA

25、片段的大小DNA片段越大，复性越慢。（4）基因组大小具有很多重复序列的DNA，复性较快。84（三）核酸的杂交n1.核酸的杂交（hybridization）：不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性；这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂化双链。n杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA与RNA之间和DNA与RNA之间。返回85第五节、核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯（一） DNA的分离n目前最重要的方法有3个：n1. 盐抽提，用苯酚或氯仿除去蛋白质。n预处理：细胞破碎n盐的作用：核蛋白（DNP）溶于浓盐

26、溶液（如1M氯化钠），但不溶于生理盐溶液（如0.14M氯化钠）n苯酚或氯仿的作用：为蛋白质变性剂，除去蛋白质。862.用广谱蛋白酶在SDS存在下保温消化细胞悬液，再用苯酚或氯仿除去蛋白质，用RNase除去少量RNA。3.氯化铯密度梯度离心法。n使用超速离心机。n氯化铯密度梯度：氯化铯在水介质中有极高溶解度；将8.0M的氯化铯溶液装入离心杯中，开动离心机，形成线形氯化铯密度梯度，自杯底的1.80g/cm3到顶部的1.55 g/cm3。n当DNA样品的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时， DNA形成一稳定的区带，漂浮于氯化铯密度梯度中的一定位置。n用注射针头从离心管侧面一定部位刺入，收集这一区带的DNA。87（二） RNA的分离nRNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更难。1、防止RNase降解的方法（1）器皿要高温、高压处理或用DEPC除去RNase；nDEPC：焦碳酸