基因工程制药概述和要点

1、基因工程制药概述和要点 第一节第一节 基因的概念与特性基因的概念与特性 一、基因的概念: : DNA分子中含有特定遗传信息的一段分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。位。 早期认为遗传物质是蛋白质，早期认为遗传物质是蛋白质，1944年年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。二、基因的一般特性：二、基因的一般特性：基因可自我复制基因可自我复制基因决定蛋白质结构基因决定蛋白质结构基因可突变。基因可突变。基因按功能分为：基因按功能分为：结构基因结构基因调控基因调控基因三、三、DNA的结构与性能的结构与性能

2、DNA的结构：四种核苷酸（的结构：四种核苷酸（A、T、 C、 G）连接。）连接。 DNA二级结构双螺旋结构。二级结构双螺旋结构。 DNA的性质与功能的性质与功能吸收光谱吸收光谱260电场中泳动电场中泳动变性、复性、杂交变性、复性、杂交 转录：在转录：在RNA聚合酶的催化下以聚合酶的催化下以DNA为模板合成为模板合成mRNA的过程。的过程。 转录后加工：转录后加工： 剪切：除去内含子剪切：除去内含子 加帽：加帽：5加加m7Gppp 加尾：加尾：3加加poly（A） 二、翻译：以翻译：以mRNA为模板，为模板，tRNA作为运载工具，将活化的氨基酸在作为运载工具，将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的

3、过程核糖体上合成蛋白质的过程。 分为三个阶段：分为三个阶段： 起始起始 延长延长 终止终止翻译后的肽链加工翻译后的肽链加工肽链切断肽链切断羟基化羟基化糖基化糖基化磷酸化磷酸化乙酰化乙酰化 20 20世纪世纪7070年代基因工程诞生最先应用年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。在医药科学领域。 19821982年第一个基因工程产品年第一个基因工程产品-人胰岛人胰岛素在美国问世。素在美国问世。 优点优点: :大量生产、应用临床、深入研大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足、扩大了药物究、扩大应用、改造不足、扩大了药物筛选来源筛选来源 。l基因工程药物和制剂很珍贵，用传统方法很难基因工程

4、药物和制剂很珍贵，用传统方法很难生产，由于材料来源困难或制造技术问题而无生产，由于材料来源困难或制造技术问题而无法大量生产，但用基因工程可以得以解决。主法大量生产，但用基因工程可以得以解决。主要是医用活性蛋白和多肽类：要是医用活性蛋白和多肽类：（1 1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体（2 2）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、）细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、表皮生长因子、凝血因子等表皮生长因子、凝血因子等（3 3）激素，如胰岛素、生长激素、心钠素等）激素，如胰岛素、生长激素、心钠素等（4 4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、超氧）酶类，如尿激酶、

5、链激酶、葡激酶、超氧化物化物 歧化酶等歧化酶等利用基因工程技术生产药品的优点（利用基因工程技术生产药品的优点（1）：大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽( (如胰岛素、干扰素、细胞因子等如胰岛素、干扰素、细胞因子等) )，为临床使，为临床使用提供有效的保障；用提供有效的保障；可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；这些物质的应用范围；可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；

6、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素改造和去除。如白细胞介素-2-2的第的第125125位半胱位半胱氨酸是游离的，有可能引起氨酸是游离的，有可能引起S SS S键的错配键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素或丙氨酸，白细胞介素-2-2的活性以及热稳定性的活性以及热稳定性均有提高。均有提高。利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

7、物筛选来源。l国际上已进入临床试验的国际上已进入临床试验的抗肿瘤抗肿瘤重组导重组导向毒素向毒素l基因工程基因工程抗肿瘤药物抗肿瘤药物l目前进入临床试验的基因组重组目前进入临床试验的基因组重组抗血管抗血管生成药物生成药物l转基因养殖动物转基因养殖动物的乳汁产生的人生物医的乳汁产生的人生物医药药l转基因植物转基因植物生产的药物蛋白生产的药物蛋白l部分基因工程药物简介：部分基因工程药物简介：1、人胰岛素、人胰岛素(InsuIin)胰岛素是多肽激素的一种，具有多种生理功能，胰岛素是多肽激素的一种，具有多种生理功能，在维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基在维持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白

8、质的合成、调节与控制细胞内多种代酸和蛋白质的合成、调节与控制细胞内多种代谢途径等方面都有重要作用。胰岛素用于临床谢途径等方面都有重要作用。胰岛素用于临床糖尿病的医治已有近糖尿病的医治已有近70年的历史，长期以来，年的历史，长期以来，其来源仅仅是从动物的胰脏中提取，而动物胰其来源仅仅是从动物的胰脏中提取，而动物胰岛素与人胰岛素在氨基酸组成上存有一定的差岛素与人胰岛素在氨基酸组成上存有一定的差异，长期注射人体时会产生自身免疫反应，影异，长期注射人体时会产生自身免疫反应，影响治疗效果。自响治疗效果。自80年代初开始，人们已开始用年代初开始，人们已开始用基因工程技术大量生产人胰岛素。基因工程技术大量生

9、产人胰岛素。l人胰岛素的基因工程生产一般采用两种人胰岛素的基因工程生产一般采用两种方式：一是分别在大肠杆菌中合成方式：一是分别在大肠杆菌中合成A链和链和B链，再在体外用化学方法连接两条肽链链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。美国组成胰岛素。美国EIi Lilly公司采用该法公司采用该法生产的重组人胰岛素生产的重组人胰岛素Humulin最早获准最早获准商品化；商品化；l另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，如丹麦原，如丹麦Novo Nordisk公司用重组酵公司用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。人胰岛

10、素。对胰岛素的改造对胰岛素的改造lNovo Nordisk研究所的研究所的Brange等应用蛋等应用蛋白质工程技术在胰岛素分子中取代一个白质工程技术在胰岛素分子中取代一个氨基酸残基，防止单体二聚化，由此合氨基酸残基，防止单体二聚化，由此合成的新型胰岛素在药物浓度下基本上保成的新型胰岛素在药物浓度下基本上保持单体，注射后吸收速度比正常胰岛素持单体，注射后吸收速度比正常胰岛素快快2-3倍；另有报道将胰岛素倍；另有报道将胰岛素B链第链第10位位的的His变为变为Asp获得高活力胰岛素获得高活力胰岛素B10Asp，其受体结合能力和离体生物活力分别为其受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的猪胰岛素的

11、262和和235。 2人生长激素人生长激素(Human growth hormone，hGH)l人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞人生长激素是人的垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素。它有多分泌的一种非糖基化多肽激素。它有多种生物功能，主要是刺激身体生长。最种生物功能，主要是刺激身体生长。最近发现近发现hGH对一些细胞的增殖和分化以对一些细胞的增殖和分化以及及DNA合成有直接效应。合成有直接效应。hGH的主要用的主要用途是治疗诛儒症，临床试验认为途是治疗诛儒症，临床试验认为hGH对对慢性肾功能衰竭和慢性肾功能衰竭和Turner综合症也有很综合症也有很好疗效。好疗效。l美国的美国的Gen

12、entech公司采用枯草芽泡杆菌系统公司采用枯草芽泡杆菌系统表达表达hGH，产量达，于，产量达，于1985年年10月批准上市，月批准上市，商品名称为商品名称为Prptropin(hGH)。1994年年3月又有月又有新产品新产品Nutyopin被批准上市。英国被批准上市。英国Cell teck公公司用哺乳动物细胞生产的司用哺乳动物细胞生产的hGH，比从垂体中提，比从垂体中提纯的天然纯的天然hGH多一个蛋氨酸，其治疗效果更为多一个蛋氨酸，其治疗效果更为显著。我国用和哺乳动物细胞表达显著。我国用和哺乳动物细胞表达hGH，1995年开始进行临床试验做完临床试验后有两家年开始进行临床试验做完临床试验后有

13、两家公司进行工业化生产。公司进行工业化生产。 3、干扰素、干扰素(Interferon，IFN)干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋和蛋白质的合成。干扰素是一种类似多肽激白质的合成。干扰素是一种类似多肽激素的细胞功能调节物质，是一种细胞素。素的细胞功能调节物质，是一种细胞素。其定义包括如以下含义：其定义包括如以下含义：(1)干扰素必须是一种蛋白质；干扰素必须是一种蛋白质；(2)在一般生理状态下，细胞的干扰素基因在一般生理状态下，细

14、胞的干扰素基因呈静止状态，只有在特定诱生剂作用下呈静止状态，只有在特定诱生剂作用下进行转录并转译出具有种属特异性的干进行转录并转译出具有种属特异性的干扰素；扰素；(3)干扰素本身不能直接灭活病毒，而是细干扰素本身不能直接灭活病毒，而是细胞在干扰素作用后产生出多种抗病毒蛋胞在干扰素作用后产生出多种抗病毒蛋白。从而阻断病毒的繁殖；白。从而阻断病毒的繁殖；(4)干扰素必须具有广谱抗病毒活性。干扰素必须具有广谱抗病毒活性。l 根据抗原特异性和分子结构的不同，干扰素可根据抗原特异性和分子结构的不同，干扰素可分为分为、三型。干扰素的基本特性包括种三型。干扰素的基本特性包括种属特异性、作用属特异性、作用“广

15、谱性和选择性广谱性和选择性”、相对无、相对无害性和特殊稳定性等。干扰素的生物功能活性害性和特殊稳定性等。干扰素的生物功能活性可归纳为：可归纳为：(1)抗细胞内侵害微生物活性，抗细胞内侵害微生物活性，(2)抗细胞分裂活性，抗细胞分裂活性，(3)调节免疫功能活性。干扰调节免疫功能活性。干扰素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病。病。l我国卫生部已批准生产的干扰素品种有：我国卫生部已批准生产的干扰素品种有：IFN1b、IFN2a、IFN2b和和IFNr四种。四种。 4白细胞介素白细胞介素(Interleukin, IL)白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生

16、白细胞介素是由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的又在白细胞间起调节作用和介导作用的因子，是一类重要的免疫调节剂。目的因子，是一类重要的免疫调节剂。目前已发现的白细胞介素已达前已发现的白细胞介素已达15种之多，种之多，它们的生物学功能十分广泛主要功能它们的生物学功能十分广泛主要功能有：有：(1)激活并刺激激活并刺激T、B淋巴细胞的增殖和分化；淋巴细胞的增殖和分化；(2)刺激巨噬细胞和粒细胞的活性；刺激巨噬细胞和粒细胞的活性；(3)作为各种细胞的丝裂原；作为各种细胞的丝裂原；(4)其他功能其他功能(抗肿瘤作用、诱导发热、作为佐剂抗肿瘤作用、诱导发热、作为佐剂等等)。白细胞介

17、素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病白细胞介素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等如乙型肝炎、艾滋病等)。l随着分子生物学的进展，各种白细胞介素的基随着分子生物学的进展，各种白细胞介素的基因也相继克隆成功，并制成基因工程白细胞介因也相继克隆成功，并制成基因工程白细胞介素纯品，其中有几种已投放市场。同内素纯品，其中有几种已投放市场。同内IL-2已已批准生产，批准生产，IL-3、IL-4和和IL-6等其他白细胞介等其他白细胞介素也正在研制中。应用蛋白质工程技术在素也正在研制中。应用蛋白质工程技术在IL-2中中125位位Cys分别由分别由Ser或或Ala取代，制成生物

18、活取代，制成生物活性、热稳定性和复性效果都比原性、热稳定性和复性效果都比原IL-2强的新型强的新型IL-2(125Ser-IL-2和和125Ala-IL-2)，现己获准临，现己获准临床应用。床应用。5. 集落刺激因子集落刺激因子(Colony stimuLating factor, CSF)集落刺激因子集落刺激因子(CSF)是一类能参与造血调节过程是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，故又称造血刺激因子或造血的糖蛋白分子，故又称造血刺激因子或造血生长因子。生长因子。 CSF的功能可概括为：刺激造血的功能可概括为：刺激造血细胞增殖、维系细胞存活、分化定型、刺激细胞增殖、维系细胞存活、分化定型、刺

19、激终末细胞的功能活性等。近年来的研究表明，终末细胞的功能活性等。近年来的研究表明，CSF还参与对成熟细胞的功能调节，并在宿还参与对成熟细胞的功能调节，并在宿主抗感染免疫中起着重要作用。主抗感染免疫中起着重要作用。现在已知的集落刺激因子现在已知的集落刺激因子(CSF)主要有主要有4种：种：(1)粒粒细胞集落刺激因子细胞集落刺激因子(G-CSF)；(2)巨噬细胞集落巨噬细胞集落刺激因子刺激因子(M-CSF)；(3)粒细胞粒细胞巨噬细胞集落巨噬细胞集落刺激因子刺激因子GM-C3F)；(4)多能集落刺激因子多能集落刺激因子(Multi-CSF，即，即IL-3)。上述。上述4种种CSF在注入人在注入人体

20、后均有促使各类白细胞增殖和成熟、增加血体后均有促使各类白细胞增殖和成熟、增加血小板和红细胞数量的作用，因此小板和红细胞数量的作用，因此CSF在临床上在临床上多用作癌化疗的辅佐药物，如化疗后产生的中多用作癌化疗的辅佐药物，如化疗后产生的中性白细胞减少症，也用于骨髓移植促进生血作性白细胞减少症，也用于骨髓移植促进生血作用，还可用于治疗白血病、粒细胞缺乏症、再用，还可用于治疗白血病、粒细胞缺乏症、再生障碍贫血等多种疾病。生障碍贫血等多种疾病。6肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)肿瘤坏死因子这一名称是因最初发现时观察到它肿瘤坏死因子这一名称是因最初发现时观察

21、到它的抗肿瘤活性而命名的。随着人们对的抗肿瘤活性而命名的。随着人们对TNF的深的深入研究，该名称已不再能反映其全部的生物活入研究，该名称已不再能反映其全部的生物活性。性。TNF除具有抗肿瘤活性外对多种正常细除具有抗肿瘤活性外对多种正常细胞还具有广泛的免疫生物学活性，如炎症活性，胞还具有广泛的免疫生物学活性，如炎症活性，促凝血活性，促进细胞因子分泌，免疫调节作促凝血活性，促进细胞因子分泌，免疫调节作用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质作用以用，抗病毒、细菌和真菌作用，热原质作用以及参与骨质重吸收等。及参与骨质重吸收等。1)主要由激活巨噬细胞产生的主要由激活巨噬细胞产生的TNF-；(2)主要由激活淋

22、巴细胞产生的主要由激活淋巴细胞产生的INF-，又名淋巴，又名淋巴细胞毒素细胞毒素(LT)；(3)由由NK细胞产生的细胞毒因子细胞产生的细胞毒因子TNF-。(NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，具有广泛的细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，具有广泛的生物学功能，位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道生物学功能，位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线。防线。NK细胞作为天然免疫的主要效应细胞，在感染细胞作为天然免疫的主要效应细胞，在感染性疾病的防治、肿瘤的生物治疗以及骨髓移植中发挥性疾病的防治、肿瘤的生物治疗以及骨髓移植中发挥了不可替代的作用。皮肤黏膜组织是机体的重要免疫了不可替代的作用。皮肤黏膜组织

23、是机体的重要免疫器官之一，是阻挡病原微生物入侵的天然屏障，而器官之一，是阻挡病原微生物入侵的天然屏障，而NK细胞是这一屏障的主要效应细胞之一。细胞是这一屏障的主要效应细胞之一。 )l1984年基因重组年基因重组TNF获得成功后，获得成功后，1985年即获美国年即获美国FDA批准用于临床，在治疗批准用于临床，在治疗某些感性肿瘤上收到较好的效果。此外，某些感性肿瘤上收到较好的效果。此外，TNF在临床诊断上也有一定意义。但天在临床诊断上也有一定意义。但天然然TNF有一定毒副反应。国内有一定毒副反应。国内1989年首年首次报道组建高表达人次报道组建高表达人TNF工程菌株。并工程菌株。并通过鉴定，重在研

24、究通过鉴定，重在研究TNF的衍生物，以的衍生物，以提高比活性和减少毒副作用。提高比活性和减少毒副作用。目前，用蛋白质工程技术研制目前，用蛋白质工程技术研制TNF突突变体主要有：变体主要有：(1)将原型将原型TNF分子中第分子中第80、90和和92位的位的Ile、Lys和和Asn分别被分别被Ser、His和和Val置换，经置换，经E. coli表达产生表达产生rhTNFD3a产物，毒性产物，毒性比原型比原型TNF低低11倍左右；倍左右；(2)将将TNFN末端的第末端的第2位位Arg换成换成Lys，在及在及E. coli中表达中表达TNFK2产物，对某些产物，对某些人肿瘤细胞株表现出比人肿瘤细胞株

25、表现出比TNP高出几十高出几十倍到几百倍的抑制活性，且毒性稍低；倍到几百倍的抑制活性，且毒性稍低；(3)在在TNF分子的末端缺分子的末端缺7个氨基酸，个氨基酸，8、9、10和和C端端157位氨基酸分别被位氨基酸分别被ArgLysArg和和Phe取代，在取代，在E. coli 中表达中表达TNF mutant protein产物，生物活性比天然的产物，生物活性比天然的提高提高10倍，可降低用药量，减低其毒副倍，可降低用药量，减低其毒副作用，且产物以可溶形式存在，易于纯作用，且产物以可溶形式存在，易于纯化。化。7心钠素心钠素(Atrial natriurctic factor ANF或或ANP)心

26、钠素是心房利钠因子。由于其化学结构属于一心钠素是心房利钠因子。由于其化学结构属于一种多肽，故又称心房肽种多肽，故又称心房肽(ANP)。心钠素具有较。心钠素具有较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压的作用。强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压的作用。在调节体液容量和浓度、控制血压、维持体液在调节体液容量和浓度、控制血压、维持体液平衡方面起着重要作用、可作为降血压药和利平衡方面起着重要作用、可作为降血压药和利尿药，用于治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾尿药，用于治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿和气喘等疾病。功能衰竭、水肿和气喘等疾病。人的心钠素基因人的心钠素基因(化学合成化学合成)已先后在大肠已先后在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表达。达。1986年年VlasukIs等已将化学合成等已将化学合成的人心钠素的人心