编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建

1、编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建      【摘要】  目的 克隆编码小鼠分泌型Klotho蛋白(secKlotho)的全长cDNA片段，构建secKlotho重组腺相关病毒载体。方法 以小鼠肾脏组织mRNA为模板，通过RTPCR扩增获得小鼠Klotho基因大片段并克隆至pMD18T载体中，再采用长臂引物进行二次PCR扩增获得编码secKlotho的全长cDNA片段，经EcoR I/Xho I酶切、连接、转化将目的片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAVMCS中，酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定。结果

2、 RTPCR成功扩增出1 600 bp的小鼠Klotho基因大片段，经二次PCR扩增得到编码secKlotho 的全长1 650 bp cDNA片段，并最终获得3个序列信息和读码框完全正确的pAAV/secKlotho克隆。结论 成功构建小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体，为Klotho基因转染治疗慢性肾功能衰竭及冠状动脉粥样硬化等疾病奠定了基础。 【关键词】  Klotho;基因克隆;腺相关病毒;载体构建【Abstract】 Objective To clone the full length cDNA coding for mouse secreted form of kl

3、otho protein (secKlotho), and to construct the recombinant adenoassociated virus (rAAV) vector carrying the open reading frame (ORF) of secKlotho (pAAV/secKlotho). Methods Using the mRNA extracted from mouse kidney as template, part of mouse klotho gene was firstly amplified by reverse transcription

4、 polymerase chain reaction (RTPCR) and cloned into pMD18T vector. Then the full length cDNA fragment coding for mouse secreted form of klotho was obtained by a second round of PCR with longarm primers. After digestion, ligation and transformation, the targeted cDNA fragment was subcloned into pAAVMC

5、S vector to construct the recombinant plasmid pAAV/secKlotho. pAAV/secKlotho was verified by restriction digestion and DNA sequencing. Results A 1 650 bp cDNA coding for secKlotho was obtained by two rounds of PCR amplification, the sequence of which was identical with that of GenBank. Three clones

6、of pAAV/secKlotho were finally identified and confirmed that the ORF of secKlotho was inserted into pAAVMCS at right position and direction. Conclusions pAAV/secKlotho is successfully constructed. The development of pAAV/secKlotho will lay the foundation for gene therapy of related diseases with klo

7、tho.【Key words】 Klotho; Gene cloning; Adenoassociated virus; Vector construction 最近，一种与人类衰老密切相关的基因Klotho引起了生命科学界的高度重视。Klotho基因缺陷小鼠在出生后4 w左右可出现一系列与人类衰老相似的表型变化，如生长阻滞和寿命缩短、动脉硬化、糖和能量代谢异常、高磷和高钙血症等1。Klotho基因共包含5个外显子和4个内含子。该基因RNA内有一个潜在的可变剪切位点，如果此位点插入一个50 bp的特定序列,所插入序列最末端的两个核苷酸TA 就会与外显子4的第一个核苷酸G组成一个终止密码TAG，

8、从而形成一个短的开放阅读框。 因此，Klotho基因可编码两种类型Klotho蛋白，一种是由全部5个外显子所编码的膜型Klotho，另外一种是因为在可变剪切位点插入了50 bp的特定序列而仅由前3个外显子编码形成的分泌型Klotho(secKlotho)2。secKlotho可在全身各处发挥作用，因而在应用方面更受关注。目前Klotho基因在衰老相关疾病中的应用研究已开始引起人们的重视，而我国开展的研究目前仅涉及该基因多态性及致病因子和药物等对该基因表达的影响3，4。基于此，本研究首先采用两步PCR法克隆编码小鼠secKlotho蛋白的全长cDNA，然后通过酶切、连接、转化等常规分子生物学技术

9、构建secKlotho重组腺相关病毒载体，为后续Klotho基因治疗动脉粥样硬化等衰老相关疾病奠定研究基础。     1 材料与方法1.1 材料1.2 方法2 结 果2.1 小鼠Klotho基因大片段的克隆与鉴定 在RTPCR反应中首先对PCR的退火温度进行梯度筛选，发现在退火温度为60时可以扩增出较特异的DNA片段，所得PCR产物大小约1 600 bp，与目的片段大小一致(见图1)。随后将该PCR产物与pMD18T载体进行连接，EcoR I / Hind 酶切结果显示目的片段成功克隆至pMD18T载体中(见图2)，DNA测序结果表明所扩增的DNA片段序

10、列与小鼠Klotho基因的前3个外显子序列完全一致。2.2 小鼠secKlotho全长cDNA片段的获得 以测序结果正确的pMD18T/Klotho质粒DNA为模板进行长臂引物PCR的再次扩增，在PCR下游引物中加载了50 bp的特定序列，结果可见大小约1 650 bp的PCR扩增片段(见图3)，表明经过二次PCR扩增获得了小鼠secKlotho的全长cDNA片段。2.3 重组pAAV/secKlotho质粒的构建与鉴定 经过EcoR I / Xho I酶切、连接、转化和氨苄青霉素抗性筛选，LB平板上有数十个可疑克隆生长，提取质粒后经EcoR I/Xho I酶切和PCR扩增鉴定，共获得3个阳性

11、重组质粒pAAV/secKlotho(见图3)。测序结果显示，3个质粒中均含有与GenBank和文献报道序列一致且读码框完全正确的小鼠secKlotho全长cDNA序列(见图4，5)，表明小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体构建成功。     3 讨 论Klotho是新近发现的一种主要在肾脏、生殖器官和脑脉络膜中表达的抗衰老基因5。研究表明，Klotho基因缺陷(Kl/Kl)小鼠在出生后4 w左右可出现一系列与人类衰老相似的表型变化，如寿命缩短、动脉粥样硬化、骨质疏松、脑卒中等，但通过诱导外源性Klotho基因表达可以使Kl/Kl小鼠的上述表型恢复正

12、常6。超表达Klotho基因可以延长小鼠的寿命，并通过抑制胰岛素和类胰岛素生长因子1信号途径发挥激素样抗衰老作用7。目前，Klotho基因与人类疾病的关系也在不断探索中。研究表明，Klotho蛋白及其代谢产物可以促进动脉血管内皮NO合成，Klotho蛋白可以提高机体对抗氧化应激损伤的能力8。在体外，它可以减轻H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡和衰老9。而Klotho基因敲除小鼠血管内皮功能发生紊乱，动脉粥样硬化形成加速10。目前，临床上对于动脉粥样硬化及其相关并发症尚无特异性的治疗方法。鉴于Klotho具有抗衰老、抗氧化应激的作用，以及它与上述特定疾病发生、发展的关系，人们设想通过Klotho

13、基因治疗或许可以对动脉粥样硬化及其他衰老相关疾病进行有效救治。研究表明，人和小鼠的Klotho有膜结合型和分泌型两种蛋白异构体，二者可能分别是膜结合受体和体液调节信号蛋白2。由于分泌型Klotho可以进入血液循环而发挥类激素样作用，所以，在本实验选择了小鼠secKlotho作为靶分子。已知，小鼠secKlotho是由Klotho基因的前3个外显子和一段48 bp的特定插入序列而编码生成(插入序列共50 bp，最后的两个碱基TA与第4个外显子的第1个碱基G组成了终止密码子)。由于该靶基因的编码形式特殊且片段较大，因此采用两步PCR法对其进行了克隆：首先提取小鼠肾组织mRNA，通过RTPCR扩增K

14、lotho基因的前3个外显子序列，并连接至pMD18T载体中，提取质粒，酶切鉴定和测序结果证实该序列正确;然后以上述质粒DNA为模板进行长臂引物PCR的再次扩增，在PCR下游引物中加载了50 bp的特定序列，经过二次PCR扩增最终获得了小鼠secKlotho的全长cDNA片段。此外，病毒载体的选择也是基因治疗的关键。近年来，国内外对转基因治疗血管性疾病进行了深入研究11。在这些实验中，常选择腺病毒载体，其优点是转染效率高，缺点是转染的基因表达时间短，大约为23 w，不适合动脉粥样硬化这种慢性疾病的防治。而腺相关病毒因为能定点整合到宿主细胞的19号染色体，其携带的外源基因可以长时间稳定表达，与腺

15、病毒相比，虽然它的转染效率略低，却具有天然的肌肉组织趋向性，可以通过肌肉注射由肌细胞分泌转基因蛋白入血，通过血液循环发挥作用，并且引起的免疫反应轻微12，13。所以，本实验选择了腺相关病毒载体作为secKlotho基因治疗的载体。为此，在获得编码小鼠secKlotho的全长cDNA后，通过常规分子生物技术将其装载至腺相关病毒载体rAAVMCS中，最终通过酶切鉴定和DNA测序证实成功构建了序列信息和阅读框完全正确的secKlotho重组腺相关病毒表达载体，从而为其在动脉粥样硬化及衰老相关疾病中的应用研究奠定了基础。【参考文献】  1 Rosenblatt KP，Kuro OM.Klotho，an agingsuppressor geneJ.Horm Res，2007;67 (Suppl 1):191203.2 ShirakiIida T，Aizawa H，Matsumura Y,et al.Structure of the mouse klo