p73基因多态性及蛋白表达与结直肠肿瘤关系的研究

1、p73基因多态性及蛋白表达与结直肠肿瘤关系的研究    【摘要】  目的 探讨p73基因的多态性及蛋白表达与结直肠肿瘤发生风险的关系。 方法 血液标本分为3组，包括结直肠腺癌组、结肠腺瘤组、结肠未见明显异常组，各60例。采用PCRRFLP方法检测血液标本p73基因多态性。组织标本分3组，分别取自结直肠腺癌病灶处、结肠腺瘤病灶处、结直肠腺癌患者的相应远离癌灶的正常黏膜组织，各30例，采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中p73蛋白表达情况。 结果 （1）p73基因多态性与结直肠腺癌、腺瘤的发生有相关性，且AT/AT基因型的人群易患结肠肿瘤。（2）p7

2、3蛋白表达与结直肠腺癌的发生、发展有相关性。 结论 p73基因多态性与结直肠癌的发生有相关性，且AT/AT基因型的人群易患结肠肿瘤。p73蛋白表达的增加或上调与结直肠癌相关。     【关键词】  结直肠肿瘤； 基因，肿瘤抑制； 肿瘤抑制蛋白质类； 多态现象，遗传    结直肠癌的发生是黏膜上皮受到遗传和环境等多种因素作用、导致多基因改变及相互作用的结果。已知p53基因是人类肿瘤中的重要抑癌基因，而p73基因作为p53家族的成员，在人类肿瘤中也起着重要作用。现已确定TAp73与p53类似，也能诱导不可逆的

3、细胞周期停滞、促进细胞凋亡，并且此功能与TAp73激活p53靶基因如Bax、p2l waf1等的转录有关1。p73基因包含一个多态性，在上游起始子AUG外显子，理论上可能形成茎环结构，被认为可以改变基因表达从而影响p73结构。笔者通过研究p73蛋白在结肠腺癌组织、腺瘤组织及正常组织的表达水平，探讨其与结肠腺癌的细胞分化程度以及肿瘤发生发展的关系。    1  对象和方法    1.1  对象  所有病例均来自福建省立医院内镜检查和外科手术治疗患者，其中结直肠癌主要指散发型，排除遗传性非

4、息肉病性大肠癌（HNPCC）。详细记录病人性别、年龄及结直肠肿瘤易感因素，如家族史、手术史、饮食等。血液标本分为3组，包括腺癌组60例，腺瘤组60例，未见明显异常组60例。组织标本分为3组，分别取自结直肠腺癌病灶处30例，结肠腺瘤病灶处30例，结直肠腺癌患者的相应远离癌灶的正常黏膜组织30例。所有腺癌或腺瘤均经过内镜形态学及病理组织学证实。“结肠未见异常”为内镜形态学上结肠黏膜光滑的受检者。所有组织标本均为10%甲醛溶液固定、石蜡包埋。    1.2  方法    1.2.1  PCRRFLP&

5、#160; 取外周血2 mL，用EDTA抗凝，基因组DNA提取试剂盒（TaKaRa D9081）进行基因组DNA提取，聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析（PCRRFLP）。PCR引物（228 bp)：    上游：5CAGGAGGACAGAGCACGAG3    下游：5CGAAGGTGGCTGAGGCTAG3    PCR循环参数：95 变性5 min，95 30 s57 45 s72 30 s，进行35个循环，最后72 延伸10 min。PCR产物中加入1 L限制性内切酶Sty1，37 孵

6、育酶切78 h，产物用2%琼脂糖胶电泳，结果用凝胶成像系统分析。    1.2.2  免疫组织化学染色  采用二步法免疫组织化学染色。p73蛋白阳性物质定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒。阳性判定标准：在显微镜中倍视野（10×10）下观察阳性细胞分布情况，分别取45个独立的高倍视野（10×40），各计数200250个细胞，阳性细胞<10%为阴性，阳性细胞>10%为阳性。比较结直肠腺癌和腺瘤以及远离病灶正常组织的细胞染色密度。    1.3  统计学处理&

7、#160; SPSS 12.0统计软件包进行统计学处理。采用2检验和Fisher确切概率法分析p73基因的多态性以及p73蛋白的表达在结直肠腺癌、腺瘤以及正常组中的差别，P<0.05为差别有统计学意义。    2  结果    2.1  p73基因多态性  当有AT时，酶切AT为156和72 bp 2个产物，GC型不能被Sty1酶切，仍为228 bp产物（图1）。p73基因多态性在结直肠腺癌、腺瘤组和正常组中的分布见表1。腺癌组和腺瘤组比较，2=1.703，P>0.0125

8、，提示p73基因在腺癌组和腺瘤组基因型频率分布无显著差异；腺癌组和正常组比较，2=9.713，P<0.0125，提示p73基因在腺癌组和对照组基因型频率分布有统计学意义；腺瘤组和正常组比较，2=5.378，P>0.0125，提示p73基因在腺瘤组和正常组基因型频率分布无显著差异。并提示AT/AT基因型的人群易患结肠肿瘤。    图1  PCR扩增产物经酶切后琼脂糖电脉结果（略）    Fig 1  Restriction analysisof p73 gene  

9、  表1  p73多态性在腺癌、腺瘤和对照组中的分布（略）    Tab 1  The distribution of the p73 genotypes frequencies    表中数据为n(%).  2=10.066，P<0.05.    2.2  p73蛋白在结直肠组织中的表达情况  p73蛋白表达定位于腺癌细胞的细胞核中，呈灶性或弥漫性分布，在结肠腺癌中呈阳性表达(图2)，在腺瘤组及对照

10、组表达减少或不表达（图3，表2）。    表2  p73蛋白在腺癌、腺瘤和远离癌灶的正常组织中的表达（略）    Tab 2  The expression of p73 protein in colorectal adenocarcinoma, adenoma and healthy group    表中数据为n.  2=15.417，P<0.05.    3  讨论 

11、0;  Hamajima等对日本人的研究未发现p73基因型与结直肠腺癌患病风险有联系；Li等对美国人进行头颈部肿瘤的研究，得出AT/AT基因型的人有着一定的结直肠腺癌患病风险；但Ryan等在p73基因的多态性研究中得出，AT/AT基因型可能不容易得食管癌的结论24。这些不同的结论，可能是基于研究人群的种族、性别、年龄、环境、社会，甚至是病理学等因素的差异造成的，也可能是肿瘤的类型不同，易患基因型也不同，这需要更多的病例来证实。A：×100；B：×400.    图2  腺癌中p73蛋白阳性表达（二步法免疫组织化学染

12、色）（略）    Fig 2  The positive expression of p73 in colorectal adenocarcinoma    A：腺瘤；B：正常组织.    图3  p73蛋白阴性表达（二步法免疫组织化学染色×100）（略）    Fig 3  The negative expression of p73 protein in colorectal adenoma

13、or healthy group(×100)    研究表明，p73在许多肿瘤组织中高表达。Yokomizo等发现，野生型p73蛋白在膀胱癌中存在过度表达；Tannapfel等利用原位杂交和免疫组织化学的方法检测到32%的肝细胞癌组织中有p73基因的高水平表达，且这些表达与患者的预后有关，而非肿瘤性肝细胞中p73基因呈低水平表达，提示p73基因的高表达与HCC有关57。DNA损伤后，E2F1诱导p73在mRNA和蛋白水平表达增加，而E2F1是受CEBP反馈调节的。用DNA损伤因子DX损伤细胞后，CEBP从细胞核内输出，解除了对E2F1的抑制，从

14、而促进了p73的表达增加 8。Ozaki认为RACK1 （receptor for activated C kinase1）在SAOS2细胞中的异位过度表达能减少p73介导的转录，并能抑制依赖p73的凋亡 9。而依赖p53的转录激活和凋亡则不受RACK1的影响，pRB则会抑制RACK1的作用。用复制缺陷的腺病毒表达p73(Adp73)转染细胞株，可提高p73的表达水平，激活目标基因p21WAF1。Adp73是有效的细胞毒素因子，能引起细胞周期停滞，诱导凋亡，并且能增加化疗的敏感性10。但也有文献报道，p73蛋白因细胞分化不同而表达不同，而不是因增殖或者肿瘤表达不同。Kamiya等发现，p73在

15、基底细胞癌和脂溢性角化病中的类似基底细胞中强表达，而在鳞状上皮细胞癌和脂溢性角化病中的类似鳞状细胞中弱表达11。本研究也显示，p73蛋白在结直肠腺癌中存在高表达现象，在30例的结直肠腺癌组织中有13例存在高表达，而在腺瘤和正常组织中分别只有3例和2例表达，提示p73蛋白的高表达可能与结肠腺癌有关。    【参考文献】  1 Fang L,Lee S W,Aaronson S A. Comparative analysis of p73 and p53 regulation and effector functionsJ. J Cell Biol

16、, 1999,147(4): 823830.2 Hamajima N,Matsuo K,Suzuki T, et al. No association of p73 G4C14toA4T14 at exon 2 and p53 Arg72Pro polymorphism with the risk of digestive tract cancers in JapaneseJ. Cancer Lett, 2002,181(1):8185.3 Li G,Sturgis E M,Wang L E, et al. Association of a p73 exon 2 G4C14toA4T14 po

17、lymorphism with risk of squamous cell carcinoma of the head and neckJ. Carcinogenesis, 2004,25(10):19111916.4 Ryan B M,McManus R,Daly J S, et al. A common p73 polymorphism is associated with a reduced incidence of oesophageal carcinomaJ. Br J Cancer, 2001,85（10）:14991503.5 Yokomizo A,Mai M,Tindall D

18、 J, et al. Overexpression of the wild type p73 gene in human bladder cancerJ. Oncogene, 1999,18(8):16291633.6 Tannapfel A,Wasner M,Krause K, et al. Expression of p73 and its relation to histopathology and prognosis in hepatocellular carcinomaJ. J Natl Cancer Inst, 1999,91(13):11541158.7 Herath N I,Kew M C,Whitehall V L, et al. p73 is upregulated in a subset of hepatocellular carcinomasJ. Hepatology, 2000,31(3):6016058 Mirko M, Faina V, Cristina R, et al. DNA damage induces transcriptional activation ofp73 by removing CEBP repression on E2F1. Nu