蛋白酶的测定方法

1、会计学1蛋白酶的测定方法蛋白酶的测定方法1、干物质失重的测定、干物质失重的测定2、蛋白酶活力的测定、蛋白酶活力的测定3、数据分析与建模、数据分析与建模4、响应曲面作图、响应曲面作图5、整改方案分析、整改方案分析干重失重发酵前干重发酵后干重干重失重发酵前干重发酵后干重（1 1）、福林试剂在）、福林试剂在碱性碱性情况下极不稳定，可被情况下极不稳定，可被酚类酚类化合物还原而呈蓝色反应。化合物还原而呈蓝色反应。（2 2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等) )。（3 3）、以）、以酪蛋白酪蛋白为底物，同酶液反

2、应，经一定时间后，加为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三氯醋酸三氯醋酸，终止酶反应，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液滤液。用。用碳酸钠碱化碳酸钠碱化，再加入，再加入福林试剂福林试剂使之发色，用分光光度计测定。使之发色，用分光光度计测定。（4 4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。 1

3、 1 福林试剂福林试剂 于于20002000mlml磨口回流装置内加入磨口回流装置内加入钨酸钠钨酸钠( (NaNa2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)100g，钼酸钠钼酸钠( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水700700mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，浓盐酸浓盐酸10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加加入入硫酸锂硫酸锂( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜水5050m1m1，混匀取去冷凝器，加入几滴混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴液体溴，再煮，再煮沸沸l5minl5min，以驱逐残溴

4、及除去颜色，溶液应以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至10001000mlml。过滤，置于棕色瓶中保过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加存。此溶液使用时加2 2倍蒸馏水稀释倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。，即成稀释的福林试剂。 2 2、0.40.4mol/Lmol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液 称取三氯醋酸称取三氯醋酸65.465.4g g，定容至定容至10001000mlml。3 3、0.4mol/L0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸

5、钠溶液 称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至10001000m1m1。4 4、0.05mol/L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液乳酸钠缓冲液 A A液：液：称取称取10.610.6g80-90%g80-90%乳酸加蒸馏水定容至乳酸加蒸馏水定容至10001000mlml。 B B液：液：称取称取1616克克70%70%乳酸钠加蒸馏水定容至乳酸钠加蒸馏水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml与与B B液液1 1mlml稀释稀释1 1倍即成倍即成0.050.05mol/L

6、 pH2.5 mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液。乳酸钠缓冲液。5 5、2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 称取干酪素称取干酪素2 2g g加入加入0.10.1mol/Lmol/L氢氧化钠氢氧化钠2020mlml在水浴中加热使溶解在水浴中加热使溶解( (必要时用必要时用小火加热煮沸小火加热煮沸) )，然后用，然后用pH2.5pH2.5乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液定容至乳酸钠缓冲液定容至10001000mlml即成。即成。 配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。 配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加

7、配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1212滴酒精消泡。滴酒精消泡。33503350酸性酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸2323滴湿润。滴湿润。6 6、100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 精确称取在精确称取在l05烘箱中烘至恒重的酪氨酸烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入逐步加入0.1mol/L盐酸盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为其浓度为1000g/m1。 再吸取此液再吸取此液10ml以蒸馏水定容至以蒸馏水定容至100ml即配成即配成100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也应及

8、时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 （1 1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(2)(2)测定步骤测定步骤 另取另取6 6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1 1mlml，各加入各加入0.40.4mo1/Lmo1/L碳酸钠碳酸钠5 5m1m1，再加入已稀释的福林试剂再加入已稀释的福林试剂1 1m1m1。 摇匀置于水浴锅中，摇匀置于水浴锅中，4040保温发色保温发色2020minmin，在波长在波长660660nmnm处测定吸光度处测定吸光度。一

9、般测。一般测3 3次，取平均值次，取平均值 以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。 准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2 2g g，用用10102020mlml蒸馏水，蒸馏水，3030浸提浸提半半小时，用滤纸小时，用滤纸过滤过滤。将滤液稀释一定倍数。将滤液稀释一定倍数( (使其测定光密度在使其测定光密度在0.20.20.40.4范范围内为宜围内为宜) )。 取四支试管，分别加入取四支试管，分别加入1 1mlml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管，置入

10、验管，置入4040水浴中预热水浴中预热3 35 5minmin。 在三支平行试验管中分别加入在三支平行试验管中分别加入1 1ml 2% ml 2% 酪蛋白溶液，准确计时保温酪蛋白溶液，准确计时保温1010minmin。立即加入立即加入2 2ml 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液，l5minl5min后用滤纸过滤。分别吸取后用滤纸过滤。分别吸取1 1mlml清液，加清液，加5 5ml 0.4Mml 0.4M碳酸钠溶液，最后加入碳酸钠溶液，最后加入1 1mlml福林福林- -酚试剂，摇匀，于酚试剂，摇匀，于4040水浴中显色水浴中显色2020minmin。 空白管中先加入空白管中先

11、加入2 2ml 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加l ml 2%l ml 2%酪蛋白溶液，酪蛋白溶液，1515minmin后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。 以空白管为对照，在以空白管为对照，在680纳米纳米波长下测波长下测光密度光密度，取其平均值。，取其平均值。 蛋白酶活力单位定义：蛋白酶活力单位定义：在在4040，pH2.5pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放下，每分钟水解酪蛋白释放1 1微克微克酪氨酸的酶量定义为酪氨酸的酶量定义为1 1个蛋白酶单位。个蛋白酶单位。 式中：式中： K K：标准曲线中标准曲线中ODOD值为值

12、为1 1所相当的酪氨酸的微克数；所相当的酪氨酸的微克数； OD OD：平行试验管的平均光密度；平行试验管的平均光密度； 4 4：试管中反应液总体积：试管中反应液总体积( (毫升毫升) )； 10 10：反应：反应1010分钟；分钟； N N：稀释倍数；稀释倍数；W W：曲的称取量曲的称取量( (克克) ) （1 1）对于同一台分光光度计与同一批福林）对于同一台分光光度计与同一批福林- -酚试剂，其工作曲线酚试剂，其工作曲线K K值可以值可以沿用，当另配福林沿用，当另配福林- -酚试剂时，工作曲线应重作。酚试剂时，工作曲线应重作。 （2 2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异

13、，故）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。使用使用DESIGN EXPERT 7.1 软件软件1、建立数学模型、建立数学模型2、模型显著性检验、模型显著性检验3、解方程，求出最佳发酵条件、解方程，求出最佳发酵条件4、求出模型所预测的最高产量。、求出模型所预测的最高产量。D esign-E xpert?S oftwareR155.328.8X 1 = A : AX 2 = B : BA c tual Fac torC : C = 65.00 1.08 1.29 1.50 1.71 1.920

14、.02 0.06 0.10 0.14 0.18 32 42 52 62 72 Free gossypol (g/g) (NH4)2SO4 (%) KH2PO4 (%) 作出本次实验的作出本次实验的2D与与3D曲面图。曲面图。 分析本次实验设计存在的问题，如何分析本次实验设计存在的问题，如何改进实验设计？改进实验设计？1、干物质失重的测定、干物质失重的测定2、蛋白酶活力的测定、蛋白酶活力的测定3、数据分析与建模、数据分析与建模4、响应曲面作图、响应曲面作图5、整改方案分析、整改方案分析1 1 福林试剂福林试剂 于于20002000mlml磨口回流装置内加入磨口回流装置内加入钨酸钠钨酸钠( (Na

15、Na2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)100g，钼酸钠钼酸钠( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水700700mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，浓盐酸浓盐酸10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加加入入硫酸锂硫酸锂( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜水5050m1m1，混匀取去冷凝器，加入几滴混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴液体溴，再煮，再煮沸沸l5minl5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，。若溶液仍有绿色，

16、需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至10001000mlml。过滤，置于棕色瓶中保过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加存。此溶液使用时加2 2倍蒸馏水稀释倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。，即成稀释的福林试剂。 2 2、0.40.4mol/Lmol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液 称取三氯醋酸称取三氯醋酸65.465.4g g，定容至定容至10001000mlml。3 3、0.4mol/L0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠称取无水碳酸钠( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至1

17、0001000m1m1。4 4、0.05mol/L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液乳酸钠缓冲液 A A液：液：称取称取10.610.6g80-90%g80-90%乳酸加蒸馏水定容至乳酸加蒸馏水定容至10001000mlml。 B B液：液：称取称取1616克克70%70%乳酸钠加蒸馏水定容至乳酸钠加蒸馏水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml与与B B液液1 1mlml稀释稀释1 1倍即成倍即成0.050.05mol/L pH2.5 mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸钠缓冲液。乳酸钠缓冲液。6 6、100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液