SODPODCATMDA和可溶性蛋白的测定

1、SOD、POD、MDA 、可溶性蛋白、脯氨酸、电导率、可溶性糖的测定一、磷酸缓冲液的配制：A 液： 0.2M 的 KH2PO4 溶液 称取分析纯 KH2PO427.216 克，用蒸馏水定容至 1000 毫升。B液：0.2M的KaHPO溶液称取分析纯KaHPO?3H2O45.644克，用蒸馏水定容至 1000毫升。 或（A液：0.2M的NaHPQ溶液 称取分析纯 NaHPQ?2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至 1000 毫升。B液：0.2M的NaaHPQ溶液 称取分析纯 Na2HPQ?12HQ 71.64 克，用蒸馏水定容至 1000 毫升。）二、酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中， 加

2、2毫升0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4C 冷冻离心 20分钟（若做可溶性蛋白， 转速为 4000转/分钟， 若不做， 则 10000转/分钟）， 上清液（酶液）倒入试管中，置于040C 下保存待用。三、SOD 的测定：1.SOD 反应液的配制：母液的配制：（1）0. 05M 磷酸缓冲液（PH=7.8 ）： A 液 21.25 ml+B 液 228.25ml 定容至 1000 ml;（2）130mM Met（甲硫氨酸）：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至 100ml;棕色瓶避光4 C保存。（3） 750卩

3、M四氮唑蓝（NBT ）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至 100 ml;棕色瓶避光4C保存。（4）100卩M EDTA-Na 2:取0.0372g EDTA-Na 2用磷酸缓冲液定容至 1000ml，棕色瓶避光保存;（5）20卩M FD （核黄素）:0.00753gFD用蒸馏水定容至 1000ml。随用随配。棕色瓶避光保存;SQD 反应混液：磷酸缓冲液：Met: NBT : EDTA-Na 2：出0的比例为15： 3: 3： 3： 2.5,按母液顺序 配制，然后依次加入核黄素和酶液。2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取 20微升的酶液，加入 3毫升，4000LUX照光30分 钟，

4、同时取两支试管， 一支做对照， 一支做空白 （对照、 空白不加酶液， 以缓冲液代替） ; 空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000LUX条件下照光30分钟，反应后遮光保存， 以空白调零，560nm比色。每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）3. 结果计算SOD 总活性（吸光度 /g FW） = （ Ack Ae）x V/（ WX 0.5 X Vt X Ack） 单位： NBT 光还原 50%为单位SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；Ae为样品管的吸光度；

5、V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml, 30ul） ； W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为 mg/g。注意 ： 1.要 10ml 离心管，不要大试管，否则枪头够不着，不好吸；2提取液预冷；3. 测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量4. 照光时间和强度严格控制，试管要透明，质地均一。四、 POD 的测定：1. 0.1M PH6.0 磷酸缓冲液的配制： A 液 219.25+B 液 30.75，定容至 1000 毫升；2. POD 反应液的配制 ：0.1M PH 6.0 的磷酸缓冲液 50 毫升于烧杯中，加入愈创木酚 28微 升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加

6、入30%H 2O219 微升混合，保存于冰箱中。3. POD 的测定 ： 20 微升酶液 +3 毫升反应液于比色皿中，以 PBS 为对照调零，在 470nm 下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值（ A470/min mg pr或厶A470/ mgFW ）表示酶活力的大小。结果计算：POD 活性 POD= （ A470X V） / （W VsXO.01 X）（u/g min） A470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）; t为反应时间（min） ; Vt为提取酶液总体积（ ml）； Vs 为测定时取用酶液体积（ ml）五、MDA 的测定：1. MDA反应液的配置：0.6

7、克TBA （硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA （三氯乙酸）定容至 100 毫升。1. MDA 的测定： 1 毫升酶液 +2 毫升 0.6%的 TBA ，封口沸水浴 15分钟，迅速冷却后 1500 转 10min 离心，取上清液，在 600、532、450nm 三个波长下比色。2. 结果计算：MDA浓度 C （umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450MDA含量（umol/g FW）=C X V/WV为提取液体积（ml） , W为样品鲜重（g）六、可溶性蛋白的测定反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，

8、定容至 1000 毫升，在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。100卩g/m牛血清蛋白（BSA）标准溶液：10mg BSA,0.9 %氯化钠溶解，定容至 100ml 测定：20微升酶液+80卩1 0.05M , pH7.8磷酸缓冲液+2.9毫升G-250放置2分钟，595 纳米比色，同时做空白（100微升缓冲液+3毫升G-250为对照调零）。结果计算： 可溶性蛋白可溶性蛋白质含量（mg/g） =（CXVT）/（WXVSX1000）C为标准曲线查得的蛋白质含量（卩g）; VT为提取液总体积（稀释后的体积 ml）; VS为测定时所用提取液体积（ml, 20卩l）; W为样品鲜重（g

9、）七、脯氨酸含量的测定试剂配制：0.3%磺基水杨酸： 3克磺基水杨酸，定容至 100毫升：2.5%酸性茚三酮（现配）：60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至 100 ml，再加入 2.5 g 茚三酮，溶解后避光保存标准脯氨酸液： 25mg 脯氨酸定容至 100nl。测定： 0.3 克叶片，加入 5 毫升磺基水杨酸研磨提取，倒入离心管，沸水浴 10分钟，冷 却3000转离心10min，吸取滤液2毫升（同时作空白，吸取2毫升蒸馏水）、2毫升冰醋酸和 3 毫升酸性茚三酮，沸水浴 40 分钟，冷却，加入 5 毫升甲苯，充分振荡，静止分层，取 上层甲苯溶液于比色皿中，以甲苯为空白对照， 52

10、0纳米下比色。结果计算：脯氨酸含量（卩g/g鲜重）=CX V/Va/W八、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（ 1 ）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫） 0.3g ，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几 遍后用吸水纸吸干水分；（ 2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml 大离心管）中，加 10ml 去离子水，在室温下放置3h,期间多次摇动，使叶片充分吸水后测定溶液电导率（R1）;（3）再放入恒温水浴锅中在100 C沸水浴中煮 20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率 （R2）；（ 4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（% =R1/R2X 100%还可以计算植株伤害程度：伤害率=（处理电导率一对照电导率）/ （煮沸电导率一对照电导率）x 100%九、可溶性糖105C杀青30 min , 85C烘干至恒重用于可溶性糖的测定将处理后的叶片称取 0.02 g于刻度试