质谱分析 法PPT课件

1、一、质谱的发展历史 1906年 J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比(m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪. 1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer) 1953-1958年 出现四极杆质量分析器(Quadrupole) 1956年 GC-MS开始联用 1959年 质谱首次用于peptide sequencing 1965年 离子共振质谱出现 1968年 电喷雾离子源Electrospray Ionization 1973年 LC-MS 1974年 Fourier transform ion cyclot

2、or resonance MS 1987-1988年 Matrise_assisted laser desorption ionization 1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究第1页/共80页质谱仪：是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子、测定分子量进行成分和结构分析.离子的生成方式：有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化)二、质谱仪第2页/共80页2-1 质谱仪的组成离子源质量过滤/分析器检测器进样部分样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIon trapTime-of-flight电子倍增器闪烁计数器+ + +

3、+ + + + + + + + + + + + + +主要组成部分: 1.进样部分；2.离子源；3.质量过滤器(分析器)；4.离子检测器第3页/共80页2-2 进样部分要求： 大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。方式： 进样板进样 进样头进样 毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱） 第4页/共80页2-3 离子源A : EI源 Electron Ionization 是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.第5

4、页/共80页EI的优缺点 优点1.高的灵敏度2.有达10万个化合物的数据库可快速检索3.可根据碎片方式鉴定未知物4.从碎片离子判定结构 缺点1.质量范围小2.有可能汽化前发生解离3.碎片过多有时看不到分子离子第6页/共80页B: FBI快速原子/离子轰击离子源Fast Atom/Ion Bombardment 使用高能量的氙原子、Cs+离子或甘油-NH4+基团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化. 基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能量撞击破坏.第7页/共80页图示第8页/共80页FBI优缺点 优点1、

5、质量数可以做到7000Da。2、快速。3、软电离方式，碎片离子少。4、容易引入阳离子形成M+Na,M+K型的正离子。5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。缺点1、质量数高时灵敏度下降严重。2、灵敏度比MALDI,ESI低。3、碎片少，结构信息少。4、基质多峰，干扰结果分析。5、样品必须能溶于基质。6、非极性物质难以离子化。第9页/共80页 C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/IonizationMALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。1

6、、使用基质，但基质为固体。2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。第10页/共80页第11页/共80页第12页/共80页常用基质1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物4、吡啶甲酸 PA5、3羟基吡啶甲酸 3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析第13页/共80页常用基质结构DHBDHBSASACCACCA第14页/共80页 MALDI的优缺点优点1

7、、质量数可达300,000Da。2、attomole 至femtomole级灵敏度。3、软电离方式，无或极少碎片离子。4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。5、适于分析复杂混合物。缺点1、分辨率低。2、1000Da以下基质峰干扰。3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。5、不能分析非共价键相互作用。6、定量时需要内校准。7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。8、对各种赋形剂的容忍度低（如含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。第15页/共80页D: ESI离子源Electrospray Ionization 4000v强电场中，样品溶液通过毛

8、细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱入口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发，液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷第16页/共80页第17页/共80页NANO-ESI喷雾照片第18页/共80页ESI特点 1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。 2、质谱图显示的是离子

9、带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。第19页/共80页电荷数和质量数的计算已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nkm/z相对丰度mjmk第20页/共80页ESI优缺点优点1、质量数可达70，000Da2、灵敏度高达femtomole级。3、软电离，可观察生物分子非共价反应。4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。5、没有基质干扰。6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。7、带

10、多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。9、特别适于测多肽的修饰。10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。3、样品需先气化，混合物不适用。4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。5、定量时需内校准。第21页/共80页E: 其他离子化方式阳离子化: 以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。 尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这一过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合

11、这一电离方式，一般多加Na+.阴离子化: 分子失去一个质子，带上负电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。第22页/共80页2-3 质量分析器（过滤器）1、质量分析器的主要指标A、质量范围（/） 所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。n第23页/共80页C、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力 分辨率R=M/R=M/ a a =M =M/(M/(M M ) ) b b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。第24页/共80页不同分辨率谱图效果第25页/

12、共80页D：分子量的表述方式1、单同位素质量monoisotopic mass 最轻的稳定同位素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。 只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。2、化学平均分子量M 根据同位素质量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。3、最高峰质量 即未分辨开质谱峰最高处的质量数。 表述方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰， m/z 8000时与最高峰质量趋于一至。第26页/共80页第27页/共80页2、质量分析器的种类A、四极杆质量分析器Quadrupole Analyzer A、B极性相反，加上一个直流电

13、压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率， DC： RF保持比率不变，数值递增，使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。DC+RF第28页/共80页四极杆质量分析器的 优点四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接1、能容忍相对低的真空度（约10 x10 Torr）2、m/z可达3000， ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。3、开销低廉。第29页/共80页B、离子阱质量分析器 三维的四极杆，RF加在环形电极上。环形电极环形电极第30页/共80页 三维的四极杆，RFRF加在环形电极上。第31页/共80页C、飞行时间质量分析器 Time-of-Fli

14、ght Analyzer 离子的E=UZ=mv 飞行时间t=t=constLvmz第32页/共80页反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS)UrefUrefTOF对真空度的要求非常高10TorrMALDI源一般同时联接Time-of-Flight Analyzer和RETOFRETOF第33页/共80页D、傅立叶回旋共振质量分析器fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance质量精度最高，达0.001第34页/共80页几种质量分析器的比较第35页/共80页 质量分析器的串联目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析 Collision-induced dis

15、sociation(CID)Ion source ion daughter ion granddaughter ion选择离子 M MS SCIDMS/MSMS/MSCIDMS/MS/MSMS/MS/MS空间串联质谱仪A、串联四极杆（三级四极杆） triple-Quadrupole AnalyzerQ 为过滤单元Q 为碰撞单元Q 为分析单元第36页/共80页第37页/共80页几种检测方式1、MS方式： 所有离子通过Q Q Q 到达检测器。2、MS/MS方式： Q 作为分析器选择母离子(前体离子），Q 作为碰撞室产生子离子，子离子由Q 分析。3、MS方式：第38页/共80页三级四极杆的几种扫描模

16、式1、子离子扫描模式：即MS/MS。2、前体离子扫描模式： Q 依次将所有离子输入Q 碰撞解离，Q 设定一个特定子离子值，只检测此特定子离子， Q 与Q 联接，当检测器检测到子离子时，质谱仪记录的是Q 中的子离子值，质谱图显示的是所有产生相同子离子的母离子。3、中性丢失扫描： Q 扫描与Q 有一特定质量差异的子离子，谱图显示的是所有特定中性分子丢失的母离子。第39页/共80页B、三级四极杆飞行时间质谱仪Quadrupole time of flight第40页/共80页C、飞行时间飞行时间质谱仪Time-of-flight/time-of-flight第41页/共80页时间串联质谱仪A、离子阱

17、质谱仪：第42页/共80页B、傅立叶回旋共振质谱仪Fourier transform-ion cyclotron resonance 离子进入共振腔后，通过调控RF，选择特定的母离子留在腔内，再引入惰性碰撞气体碰撞,产生碎片,并检测碎片离子，这一过程不断重复至MS。第43页/共80页几种串联质谱优缺点对比优点优点缺点缺点三三级级四四极极杆杆质量精度高，分辨率好质量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全。碰撞能量低，碎片不完全。RTOFRTOF价廉价廉前体离子选择困难前体离子选择困难子离子分辨率低。子离子分辨率低。FTFTMSMS质量精度最高，质量精度最高，子离子分辨率好，子离子分辨率好，非常适

18、合多级非常适合多级质谱质谱低能量碰撞，需超导磁体，低能量碰撞，需超导磁体，价高。价高。离子阱离子阱相对价廉，相对价廉，质量精度高，分辨率好，质量精度高，分辨率好，适合多级适合多级质谱质谱低能量碰撞低能量碰撞Q QTOFTOF质量精度高，分辨率好，前体离质量精度高，分辨率好，前体离子选择性好，子选择性好，E ESISI、MAMAL LDI I均可接。均可接。需高真空，需高真空，价高。价高。第44页/共80页2-4 检测器1、电子倍增检测器：真空度低，表面易污染，寿命一般12年。第45页/共80页2、光电转换倍增器（闪烁计数器） 电子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光子由光子放大器检测。光子放大器密封在

19、容器中，光子可穿过密封玻璃，避免表面污染，寿命为5年。第46页/共80页3、HED(High-Energy Dynode Detector)在离子倍增器前加一个加速静电场，离子加速 后产生更多的二级电子引发电子雪崩，灵敏度更高。4、FT-MSFT-MS本身就是一个检测器，因为离子诱导产生的可检测电流与m/z有关第47页/共80页色谱-四极杆质谱仪结构示意图第48页/共80页三、 质谱图 丙酮的质谱。图中的竖线称为质谱峰，不同的质谱峰代表有不同质荷比的离子，峰的高低表示产生该峰的离子数量的多少。质谱图的质荷比（m/z）为横坐标，以离子峰的相对丰度为纵坐标。图中最高的峰称为基峰。基峰的相对丰度常定

20、为100%，其它离子峰的强度按基峰的百分比表示。在文献中，质谱数据也可以用列表的方法表示丙酮的质谱第49页/共80页3-1 离子主要类型 1、 分子离子 （1）分子离子形成 样品分子失去一个电子而形成的离子称为分子离子。所产生的峰称为分子离子峰或称母峰，一般用符号 表示。其中“+”代表正离子，“ ”代表不成对电子。如： e2MeM分子离子峰的m/z就是该分子的分子量。第50页/共80页（2）形成分子离子时电子失去的难易程度及表示方法 有机化合物中原子的价电子一般可以形成键、键，还可以是未成键电子n（即独对电子），这些类型的电子在电子流的撞击下失去的难易程度是不同的。一般来说，含有杂原子的有机分

21、子，其杂原子的未成键电子最易失去；其次键；再次是碳-碳相连的键；而后是碳-氢相连的键。即失去电子的难易顺序为： 杂原子C=CCCCH 易 难第51页/共80页（3）分子离子峰的强度与结构的关系 分子离子峰的强度与结构的关系有如下规律： a 碳链越长，分子离子峰越弱； b 存在支链有利于分子离子裂解，故分子离子峰很弱； c 饱和醇类及胺类化合物的分子离子弱； d 有共振系统的分子离子稳定，分子离子峰强； e 环状分子一般有较强的分子离子峰 第52页/共80页 综合上述规律，有机化合物在质谱中的分子离子的稳定性（即分子离子峰的强度）有如下顺序： 芳香环共轭烯烯环状化合物羰基化合物醚酯胺酸醇高度分支

22、的烃类。 第53页/共80页（4）分子离子峰的识别方法（i）注意m/z值的奇偶规律 只有C. H. O组成的有机化合物，其分子离子峰的m/z一定是偶数。在含氮的有机化合物（N的化合价为奇数）中，N原子个数为奇数时，其分子离子峰m/z一定是奇数；N原子个数为偶数时，则分子离子峰m/z一定是偶数。（ii）同位素峰对确定分子离子峰的贡献 利用某些元素的同位素峰的特点（在自然界中的含量），来确定含有这些原子的分子离子峰。（iii）注意该峰与其它碎片离子峰之间的质量差是否有意义 通常在分子离子峰的左侧314个质量单位处，不应有其他碎片离子峰出现。如有其它峰（出现），则该峰不是分子离子峰。因为不可能从分子

23、离子上失去相当于314个质量单位的结构碎片。第54页/共80页2、 碎片离子 碎片离子是由于分子离子进一步裂解产生的。生成的碎片离子可能再次裂解，生成质量更小的碎片离子，另外在裂解的同时也可能发生重排，所以在化合物的质谱中，常看到许多碎片离子峰。碎片离子的形成与分子结构有着密切的关系，一般可根据反应中形成的几种主要碎片离子，推测原来化合物的结构 第55页/共80页3、亚稳离子 质谱中的离子峰，不论强弱，绝大多数都是尖锐的，但也存在少量较宽（一般要跨25个质量单位），强度较低，且m/z不是整数值的离子峰，这类峰称为亚稳离子（metastable ion）峰。（1）亚稳离子的产生 正常的裂解都是在

24、电离室中进行的，如质量为m1的母离子在电离室中裂解： m1+ m2+ 中性碎片 第56页/共80页 生成的碎片离子就会在质荷比为m2的地方被检测出来。但如上述的裂解是在m1+离开了加速电场，进入磁场时才发生，则生成的碎片离子的能量要小于正常的m2+。因它在加速电场中是以m1的质量被加速，而在磁场中是以m2的质量被偏转，故它将不在m2处被检出，而是出现在质荷比小于m2的地方，这就是产生亚稳离子的原因。一般亚稳离子用m*来表示。 m1、m2、和m*之间存在下列关系： m* = m22 / m1 第57页/共80页（2） 亚稳离子的识别a 一般的碎片离子峰都很尖锐，但亚稳离子峰钝而小；b 亚稳离子峰

25、一般要跨25个质量单位；c 亚稳离子的质荷比一般都不是整数。 （3）亚稳离子峰在解析质谱中的意义 亚稳离子峰的出现，可以确定 m1+ m2+ 的开裂过程的存在。但须注意，并不是所有的开裂都会产生亚稳离子。所以，没有亚稳离子峰的出现并不能否定某种开裂过程的存在 第58页/共80页4、同位素离子 质谱中还常有同位素离子（istopic ion）。 在一般有机化合物分子鉴定时，可以通过同位素的统计分布来确定其元素组成，分子离子的同位素离子峰相对强度比总是符合统计规律的。如在CH3CI、C2H5CI等分子中CIm+2/CIm=32.5%，而在含有一个溴原子的化合物中(M+2)+峰的相对强度几乎与m+

26、峰的相等。同位素离子峰可用来确定分子离子峰。第59页/共80页5、重排离子 重排离子是由原子迁移产生重排反应而形成的离子。重排反应中，发生变化的化学键至少有两个或更多。重排反应可导致原化合物碳架的改变，并产生原化合物中并不存在的结构单元离子。第60页/共80页3-2 质谱解析及应用 1、质谱解析 解析未知物的图谱，可按下述程序进行。 第一步 对分子离子区进行解析（推断分子式）（1）确认分子离子峰，并注意分子离子峰对基峰的相对强度比，这对判断分子离子的稳定性以及确定结构是有一定帮助的。（2）注意是偶数还是奇数，如果为奇数，而元素分析又证明含有氮时，则分子中一定含有奇数个氮原子。（3）注意同位素峰

27、中M+1/M及M+2/M数值的大小，据此可以判断分子中是否含有S、CI、Br，并可初步推断分子式。（4）根据高分辨质谱测得的分子离子的m/z值，推定分子式。 第61页/共80页 第二步 对碎片离子区的解析 （推断碎片结构） （1）找出主要碎片离子峰。并根据碎片离子的质荷比，确定碎片离子的组成。常见碎片离子的组成见表离子 失去的碎片 可能存在的结构M-1 H 醛，某些醚及胺M-15 CH3 甲基M-18 H2O 醇类，包括糖类M-28 C2H4，CO，N2C2H4， 麦氏重排，COM-29 CHO，C2H5 醛类，乙基M-34 H2S 硫醇M-35 CI M-36 HCI 氯化物M-43 CH3

28、CO，C3H7 甲基酮，丙基M-45 C00H 羧酸类M-60 CH3COOH 醋酸酯第62页/共80页（2）注意分子离子有何重要碎片脱去m/e 离子 可能的结构类型29 CHO、C2H5 醛类、乙基30 CH2NH2 伯胺43 CH3CO CH3CO C3H7 丙基29、43、57、71 等 C2H5、C3H7 直链烷烃39、50、71 芳香化合物 芳香化合物52、65、7760 CH3COOH 羧酸类、醋酸类91 C6H5CH2 苄基105 C6H5CO 苯甲酰基第63页/共80页（3）找出亚稳离子峰，利用m* = m22 / m1，确定m1与m2的关系，确定开裂类型。第三步 提出结构式 根据以上分析，列出可能存在的结构单元及剩余碎片，根据可能的方式进行连接，组成可能的结构式 第64页/共80页例 1 某未知物经测定是只含C、H、O的有机化合物，红外光谱显示在3 1003 600 cm1之间无吸收，其质谱如图，试推测其结构。图 未知物质谱图第65页/共80页 解：第一步 解析分子离子区 （1）分子离子峰较强，说明该样品分子离子结构稳定，可能具有苯环或共轭系统。分子量为136。 （2）根据M+1/M=9%，可知该样品约含8个C原子，查贝农表（一般专著中都有此表），含C、H、O的只有下列四个式子： （a）C9H12O (= 4)