Western-Blotting试验报告

1、Western BIott i ng本次试验的目的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定目标蛋白的原 理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相 载体上，NC膜）上，并利用DNA-SouthernRNA和对RNA的印迹分析称为 对单向电泳后而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern 建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为印迹法。而后人们用类似的方法，对蛋白质进行印迹分析，Northern印迹法

2、，的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子 的印迹分析称为Eastern印迹法。Western既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定蛋白质最方便也是 最通用的方法。它通常分为两种方法:Western Blotting方法一：直接法方法二：间接法优点：1 快速（一种抗体）1.免特异性不受标记 影2.没有二抗交叉反应引紀的非特异性条带响2. 信号放大灵敏度高（务个二抗结合位点）3. 多种标记的二抗可 供选择4.可选择不同的Marker缺点：1. 免疫反应性降低2. 无信号二级放大3. 抗体标记费时昂贵，使1. 交叉反应引起的非 特异性条带2. 额外的二抗孵育以 及主要有

3、同时Western又具有多种识别蛋白质的显色方法，i.放以下几种:射自显影ii底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。Western Blotting （蛋白质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋 力的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键且能保持电形式吸附蛋白质，泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载与之对应的第一抗一抗再与酶或同体上的蛋白质为抗原， 体发生免疫结合反应，位素标记的第二抗体发生免疫结合反应，经过底物显色活放射自显影以 检查电泳分离的提议目的蛋白成分。蛋白质印迹技术结合

4、了凝胶电泳分辨力高和固 相免疫测定特异性咼、定抗原进行鉴别和定量敏感等诸多优点， 能从复杂混合物中对特检测。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）、N, N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）和催化剂（AP）、加速剂（TEMED聚合成的三维网孔结构（凝胶）。据有无浓 缩效应可将电泳分为两类：i. 连续系统：缓冲液pH值 凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子 筛效应区分。ii. 不连续系统：缓冲离子成分、pH值 凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应 分子筛效应 浓缩效应区分。SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的 净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了 SDS和貌基乙醇，因此它

5、还可以改变 蛋白 质构象:印迹法需要较好的 是蛋白质样品达在实验中要注意: 蛋白质凝胶电泳技术,到良好的分离效果，而且要注意胶的质量，是蛋白质容易转移带固相支持 物上，另外蛋白质在电泳过程中分离得到的条带被保留在膜上，在随后的宝物 阶段不丢失和扩散。免疫印迹分析之需要很小体积的时间，较短的时间过长，操作 容易，适用于理论和应用上的研究。本实验采用人血清为材料，人类lg根据其重链稳定区的分子结构和抗 原特异性的不同，分为五类：IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgEo其中IgG占血 清免疫球蛋白总量的75%80% o人的IgG由两条重链和两条轻链组成，它们之 间以二硫键相连。在加SDS的电

6、泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的蔬 基,四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。对此 样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )后，用电转移法将蛋白质转印到 硝酸纤维素薄膜上，用兔抗人IgG为第一抗体，用辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，在过氧化物酶第五存在的情况下，检测人的IgGo 二、试剂，器材和实验材料【试剂】1. 30 %丙烯酰胺贮备液: 烯酰胺，加重蒸水29. 2g丙烯酰胺，0. 8g甲叉双丙至 100ml o2. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L Tris-HCI , pH6. 8。3. 分离胶缓冲液：3mol/L Tris-HCI，p

7、H8.9。4. 10%过硫酸钱(w/v)：临用前用蒸f留水配制。5. 10 % SDS (w/v) o6. 10% TEMED o7. 电极缓冲液：甘氨酸11.28g, SDS 0. 4g, Tris 2. 4g,加水至800ml, pH8. 3O8. 样品缓冲液：0.1mol/L Tris-HCI缓冲液，pH6.8, 20%甘油，4% SDS, 10%疏基乙醇，0.005%漠酚兰。9. 考马斯亮蓝R250染色液:考马斯亮蓝R2500. 25g ,30%乙醇，10%冰乙酸。10. 脱色液：乙醇6ml,冰乙酸2ml,加水至20ml。11. TBS( Tris-HCI,NaCI )缓冲液：20mm

8、ol/L Tris-HCI,12. 500mmol/L NaCI ,pH7.5,每组配 150ml o13. TTBS：取 100m I TBS ,加 250 I 20% Tween-20。14. 封闭液及抗体稀释液:15. 底物溶液：+10 I H202,临用前配制。3%脱脂奶粉-TBS,每组配10mlo2. 5mg 二氨基联苯胺(DAB) + 10ml TBS考马斯亮蓝R250染色液:考马斯亮蓝R2500. 25g ,30%乙醇，10%冰乙酸，总体积500ml o17.脱色液：乙醇6ml,冰乙酸2ml,加水至20ml o1. 夹心式电泳槽2. 转移电泳槽3. 电泳仪【实验材料】1. 人血清

9、2. 硝酸纤维素膜三、实验步骤I SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1 灌月交前的准备：将两块玻璃板洗净晾干或用吹风机吹干，嵌入本体 的凹槽中，长玻板朝外，短玻板朝内，两块玻璃板之间就形成了凝胶室。 合上滑块，拧螺栓锁紧凝胶室，检查凝胶室底部是否与本体底端重合。然后 将以上组合放入制胶架，插入并旋转凸轮，即可灌胶。2. 配制胶液胶液浓度%分离胶浓缩胶12%4%30%贮备液(mI)3.20. 53分离胶缓冲液（ml）2浓缩胶缓冲液（ml）1.0重蒸水 (ml)2. 662. 3610%SDS (uI)8040混匀后再加入以下试剂：10%TEMED(ul)804010 %过硫酸钱(ul)4020总体积(ml

10、)843灌 胶:将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶 液加至距短玻璃板顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心 加入厚约0.5cm的水层，以保持分离胶面平整，同时隔绝空气，空气中的氧对凝胶的聚合有阻碍作用。待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已 聚合,大约30min完成聚合。倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶 液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端5插上样品梳，放置待其聚合。4.配制电极缓冲液：甘氨酸14. 1g, SDS 0. 5g, Tris 3g,加水至 1000ml,pH8.3O 每组配 1000ml 050 I5.制样：5 I人血清，力口45 I水，再加

11、加样缓冲液。沸水浴加热8分钟,WOOOrpm离心2分钟，取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。6力口样：1 x加入电极缓冲液；a）拔出样品梳；用微量进样器加样，中b）选3个样品槽，间槽加入 5l分子量标准蛋白样品，两旁槽各加入10 I人血清闕。120V电泳，当漠酚蓝前 沿到达距底部0. 5cm左右时，停止电泳。7切月交：根据切割线，先竖切后横切，宽胶条为两泳道，含人血清样和分子量标准蛋白样，考马斯亮蓝R-250全蛋白染色。窄胶条为一泳道，为人血清样，转印后对目标蛋白免疫染色。8.月交条保存：将两个胶条用保鲜袋包好，贴上标有自己名字的标签-20C冻存。II转印蛋白质到硝酸纤维素

12、膜上1. 将带有人血清和标准蛋白的宽胶带用考马斯亮蓝R250染色 脱色：将 宽胶条放到培养皿中，用蒸f留水清洗后，加入约10ml考马斯亮R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。更换几次脱色 液，至背景无色透明，条带清晰为止。2.放置NC膜和胶条:a）切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min 使之湿润。b）（2） 准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。c）打开转移转移槽的胶板，依次放入：a. 一张浸湿的海绵b.张浸湿的滤纸c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d）硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e. 张浸湿的滤纸

13、f.张浸湿的海绵。3. 转移：小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移 电泳槽中，加转移缓冲液至满。插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关 调至稳压60V,电泳1h,转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。III膜的酶联免疫染色1. 封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。力口封闭液1ml后圭寸闭开口，37 C摇床上摇动30min。2. 加封闭液及抗体a）与第一抗体结合（1）弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液（兔抗人IgG）,封口后37 C摇床上轻轻摇动50min。(2) 取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1mino再封入一新的塑料薄膜袋内。b)与

14、酶标第二抗体结合(3) 加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG, 37C摇床上轻轻摇动50m i n。(4) 取出膜，用TTBS洗3次，每次1min,最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底 物。转入水中保存。3. 结果分析：在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。测量分子量标 准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。实验结果:做标准蛋白曲线的的凝胶的总长为7. 53cm条带1条带2条带3条带4条带5条带6蛋白条带标准分子量

15、66.245.035.25.018.414.4Mr/KDa01 ogMr1.821.651.51.401.261. 164蛋白质条带迁移距离/cm1.582.413. 174. 185. 155.82相对迁移率0.210. 320.40. 560. 680. 772带有人血清IgG的硝酸纤维素膜的总长为7. 24cm数值IgG轻链迁移 距4. 08IgG轻链相 对迁移率IgG重链迁移 距2. 38IgG重链相 对迁移率0.560. 332系列1线性（系列y 二-1. 1451x + 2.03660.20.40.60.8相对迁移率Mry 二-1. 1451 x + 2. 0366 知:当X （重

16、链相对迁移率） 相当分子量45.57KDa当X （轻链相对迁移率） 相当分子量二0.33 时，y=1.6587 得 IgG 重链二0.56 时，y=1.3953 得 IgG 轻链24. 85KDa实验注意事项:1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有神经毒性， 皮肤上，如有沾染可注意不要沾在用水洗净。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2电泳槽只能用水冲洗，不能用刷子刷，以免刷断钳电极丝；注意保护玻璃板。3一抗的选择是影响免疫印迹成败的主要因素。多克隆抗体结合抗原能力强、灵敏度高，但易产生非特异性的背景；单克隆抗体识别抗原特异性较好，但可能不识别在样品制备时因变性而失去了空间构型的抗原表位，且 易发生交叉反

17、应。因此，兼有多克隆抗体和单克隆抗体优点的混合单克隆抗体 近年特别被推荐，它是由一组能与抗原分子中的不同且不易变性的抗原表位 结合并不易出现交叉反应的单克隆抗体混合构成。4. 如果反应灵敏度不咼，可增加凝月父的厚度到1.5mm （厚度超过2. Omm时，凝胶转移效率受限）；也可在电泳条带不发生变形的前提下，尽量提 咼蛋白样品的上样量。5滤纸 /凝胶/转印膜/滤纸夹层组合中不能存在气泡，可用玻璃棒在 夹层组合上滚动将气泡赶出，以提高转膜效率；上下两层滤纸不能过大，避免导致 接触而引起短路。6.如果出现非特异性的高背景，可观察仅用二抗单独处理转印膜所产生 的背景强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时 间；并考虑延长每一步的清洗时间。7. 一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定最佳条件。8.般情况使用0.45 |im的NC膜，0.10.2 |i m的小孔径膜只适合 于分子量小于20kD的蛋白质。二、实验思考题：1. 12%的分离胶适合分离多少分子量范围的蛋白质？答：由分子克隆中的分离胶浓度与蛋白质分子量线性关系图知，12% 的分离胶适合分离分子量范围在15-60KDa的蛋白质。2. 电极缓冲液中甘氨酸的作用？答：SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸