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原位分子杂交原位杂交核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。分子生物学技术中的杂交液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交菌落原位杂交 Colony in situ hybridization斑点杂交 Dot blotSouthern 印迹杂交Northern 印迹杂交原位杂交又称原位杂交组织化学依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子原位杂交原理变性(denaturation)-双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程复性(renaturation)-变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构退火u 杂交(hybridization)-不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起n 探针(probe)-一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段u 靶核酸分子-所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA原位杂交基本原理利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分【原位杂交优点】F 既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性F 既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究F 所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本F 应用范围广探针及其制备探针的长度：以选择50300bp最为适宜（一）探针的种类与制备 根据标记方法不同，分为放射性探针和非放射性探针 原位杂交的探针分子：cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针 cDNA探针（complementary DNA）双链cDNA探针是最常用的核酸探针通常容易得到的cDNA探针是克隆于质粒载体中的特异cDNA分子【制备方法】用生物工程技术获取特异的cDNA片段从mRNA逆转录生成cDNA构建cDNA 文库筛选和克隆特异cDNA 分子特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组 质粒转化 质粒扩增 质粒抽提、酶切、纯化得到特异的cDNA探针【优点】1. cDNA探针不含内含子序列, 特别适用于基因表达的研究 2. DNA探针一般较RNA探针敏感3. 克隆于质粒载体中, 使用方便, 不需再次克隆4. 多种标记方法, 可靠易行5. 杂交适宜温度范围较宽, 较稳定, 不易降解【缺点】1. 要用凝胶电泳移除载体序列2. 探针需变性3. 杂交反应中可能存在自身复性 RNA探针-体外转录技术制得u 一类新型的载体: 噬菌体pSP和pGEM这类载体在多克隆位点的二侧分别带有SP6启动子和T7启动子, 在SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶作用下, 可以进行RNA转录u 将外源特异cDNA片段插入多克隆位点接头处DNA重组体转化细菌质粒扩增质粒抽提体外转录合成RNA探针【优点】F 单链分子, 在组织内通透性好, 杂交效率比DNA探针高F RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定F 通过改变外源DNA插入方向, 或选用不同的RNA聚合酶, 可转录出正义RNA链和反义RNA链 反义RNA链-又称cRNA链, 用作杂交的探针 正义RNA链-用于杂交的阴性对照 F 杂交体所需解链温度高, 能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤【缺点】1. 容易受RNA酶污染2. 制备过程复杂3. 杂交适宜的温度范围较宽 寡核苷酸探针根据靶核酸序列而设计, 在DNA合成仪上用化学方法合成的短链探针【优点】 1. 1050bp, 在组织内通透性好 2. 单链DNA寡核苷酸, 杂交时无需变性, 无自身杂交 3. 一次合成, 可使用多时, 价格低廉 4. 对RNase不敏感, 比RNA探针更稳定, 便于操作【缺点】1. 与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定2. 探针较短, 所携带的标记物较少, 特异性、敏感性都低3. 标记方法受限制, 只能采用末端标记法 探针的标记1. 标记物 理想的标记物应具备的条件:F 标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同F 标记后探针的检测方法要简便, 准确, 可靠, 重复性好F 安全无害目前常用标记物有同位素和非同位素二大类n 同位素标记探针: 35S, 32P, 33P 和 3Hu 非同位素标记探针n 生物素: 生物素广泛的存在于动物体内 内源性生物素对杂交信号的干扰 地高辛: 半抗原, 从洋地黄植物的花和叶中提取 杂交信/噪比高, 敏感性高 非同位素标记物中的最佳选择2. 标记方法n (1) 双链cDNA探针的标记随机引物法 (random primed DNA labelling)n (2) RNA探针标记-在体外转录技术中与探针制备同时完成 (3) 寡核苷酸探针标记-主要是末端标记法(end-labelling )标记探针的纯化与检验纯化: 将标记反应中未被结合的,即游离的标记dNTP,与掺入cDNA或cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的部分去除纯化的方法: 普通凝胶柱层析, 离心凝胶层析, 乙醇沉淀法检验:斑点印迹法，液闪法原位杂交方法(一) 探针及其标记(二) 组织样品制备1. 去除或抑制RNA酶物理方法: 1. 对耐高温的实验器具 高温烘烤180 3小时以上 2. 实验用试剂, 耐热塑料器具 120 30min化学方法: 杂交用试剂均应用DEPC水配制 对不耐热的器具可浸于DEPC水中, 室温处理23h实验中注意戴口罩和手套操作DEPC-焦碳酸二乙酯 (diethylpyrocarbonate)通过与组氨酸结合而使蛋白质变性配制: 0.1%DEPC水 37水浴恒温振荡过夜2. 取材及固定u 取材：组织要求新鲜 如有可能尽量使用灌流固定 手术材料最好在组织离体后30min内取材并立即进行固定 取材过程中防止RNA酶的污染固定1. 目的：避免组织细胞中核酸的降解，保存组织细胞形态结构的完整 2. 固定方法: 灌流法, 浸泡法 浸泡法: 一般将组织块切成0.51.0cm3大小, 浸泡于15倍左右体积的固定液中, 固定24hr 冰冻切片或细胞培养标本, 固定2030min3. 固定时间4. 常用固定剂: 4%多聚甲醛, 10%甲醛 包埋和切片石蜡包埋和切片方法同常规操作过程中防止RNA酶污染 戴手套操作 切片刀用DEPC水擦拭，镊子消毒后使用 切片时，用0.1%DEPC水展片 新鲜切片60烘烤1624hr 玻片的处理q 玻片上涂上粘附剂q 常用粘附剂: APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷) 多聚赖氨酸 明胶q 防脱处理后高温消毒 原位杂交实验1. 杂交前处理 目的: 提高组织的通透性，增加靶核酸分子的可及性 常用方法: 脱蜡，去污剂， 表面活性剂：Triton X-100，SDS，Tween 蛋白酶：蛋白酶K，胃蛋白酶2. 预杂交: 将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育3. 探针和靶核酸的变性 杂交滴加含有探针的杂交液(20l/片), 盖上盖玻片或无菌的石蜡膜, 置于湿盒内, 在合适温度的烘箱内杂交q 杂交液 钠盐: 5 X SSC (标准柠檬酸钠-氯化钠溶液) 50%去离子甲酰胺 硫酸葡聚糖 牛血清白蛋白, 鲑鱼精DNA等q 探针浓度 放射性标记探针-0.5ng/l 非放射性标记探针-2ng/ln PH值: 通常使用缓冲液PH7.27.4q 杂交温度: 一般低于相应杂交体的Tm值25q 杂交时间q 杂交环境: 湿盒内加少量与杂交液相同渗透压的SSC (5X SSC)杂交后漂洗在高严格度条件下，漂洗除去未参与杂交体形成的过剩探针，消除探针与组织细胞的非特异结合高严格度条件：指高的温度，低的钠离子浓度一般用浓度递减的SSC溶液在一定温度和振荡下漂洗切片：2X SSC1X SSC0.5X SSC 杂交后信号检测q 同位素标记探针: 放射自显影q DIG标记探针: AKP或HRP标记的抗DIG抗体显示系统 DIG-AKP检测系统: 以NBT/BCIP为底物显色, 结果为紫蓝色沉淀 DIG-HRP检测系统: 以DAB/H2O2为底物, 结果为棕阴性对照试验 方法 作用l 杂交前用核酸酶处理 如果杂交信号明显降低或消失, 说明探针是与组织细胞中 l 的核酸杂交l 杂交液中省去探针 如果出现阳性反应, 说明这些信号是与杂交反应无关的l 用正义核酸探针 如果无杂交信号, 表明探针的特异性l 加过量未标记探针杂交后 阻断标记探针与待测核酸的结合, 如杂交 再加标记探针 杂交 信号消失或下降, 表明探针杂交的特异性5. Northern或Southern分析 如果在待测核酸的分子量大小处显示一条杂交信号带, 表明探针的特异性6. 将标记探针与未标记探针按 如果杂交信号随标记探针量的增加而增一定比例混合, 然后杂交 加, 说明探针是特异的 实验中可能出现的问题原位杂交实验失败1. 探针 探针的敏感性; 保存的好坏, 保存时间 探针浓度; 探针长度2. 组织材料的保存3. 实验过程中防止RNase污染, 做到严格的无RNase操4. 杂交前处理: 蛋白酶消化的浓度, 时间 PK在冰冻切片浓度为0.52g/ml 石蜡切片浓度1020g/ml5. 杂交条件: 温度 时间6. 杂交体检测脱片F 玻片的防脱处理F 杂交前预处理时蛋白酶的浓度，消化时间F 杂交后漂洗过度非特异性染色F 探针特异性不高F 组织细胞内内源