【毕业学位论文】（Word原稿）胃癌细胞株BGC-823中Notch1调控MMP-9表达的研究-肿瘤医学

兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 1 - 前言 恶性肿瘤是中国人口的第二大死因， 胃癌是其中最常见的恶性消化道肿瘤。全球每年新发胃癌 100余万例，中国占 42%； 死亡约 80万例，中国占 35%。因此， 我国是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一，此两项指标均高于世界平均水平两倍以上 1。 目前医学界公认，根治性手术切除在胃癌外科治疗中是最有效的方法，但术后五年生存率仅为 55 左右 2。尽管近年来对胃癌的研究已经取得了较大的进展，但其早期诊断和治疗效果依然不尽如人意，尤其是对于晚期和伴有淋巴结转移以及脏器转移的胃癌患者的治疗 3。 从疾病发生的过程来看 ，肿瘤的侵袭和转移是引起胃癌患者预后不良和死亡的主要原因 4。 也是 影响恶性肿瘤治疗困难 和生存率低的因素。 因此对恶性肿瘤侵袭和转移的分子机制的研究，可以为抗肿瘤治疗和改善预后提供理论依据， 有助于找 寻 防治肿瘤转移的有效 方法 。 肿瘤的转移通过一系列的步骤，包括肿瘤细胞侵袭，基底膜降解和细胞外基质降解，最后导致肿瘤细胞转移。 基质金属蛋白酶 （ 族是细胞外基质降解相关的酶，被认为是促进肿瘤侵袭和转移的重要因子。 肿瘤侵袭和转移中起着很关键的作用，因为其可降解 的多种蛋白质成分，进而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，故在肿瘤侵袭和转移中的作用越来越受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。 一类结构中含有 金属离子 的肽链内切酶基因家族， 根据作用 底物和结构 同源性， 族可分为 六大类： 胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、 膜型金属蛋白酶 和其他分泌型 在 族中， 重要成员，主要来源于巨噬细胞，是 子量为 92 型胶原酶）， 有效的降解基底膜的主要成分型胶原蛋白 5，而细胞外基质的主要成分是型 胶原蛋白。可见 肿瘤细胞脱落、侵袭及转移中起着非常重要的作用，所以认为是肿瘤侵袭转移的重要因子 6。 大量的研究发现， 甲状腺癌 7、结肠癌 8、乳腺癌 9等癌组织中的表达显著高于正常组织，并且与临床分期、淋巴结转移关系密切。 10用免疫组织化学的方法检测 91 例胃癌患者的胃癌组织 ,发现 表达和进展期胃癌的淋巴结转移密切相关。经统计学分析 ,微血管密度与 正相关 ,从而认为 以促进胃癌侵袭。 潘海邦等 11研究发现，胃癌中 高表达，且与胃癌的分化、侵袭、转移、临床分期均密切相关，由此提示 胃癌的侵袭、转移、预后有密兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 2 - 切关系。 919年发现于果蝇，该种基因突变可造成果蝇翅膀锯齿样缺损。 究组 1983年首次克隆了该基因，并命名为 随后的研究发现， 家族成员在进化上高度保守的跨膜受体蛋白家族，几乎参与全部细胞组织的增殖、分化、凋亡等多种重要的生命活动过程，并发挥不同的调控作用。 导通路是由 前发现，哺乳动物中有 4个同源性 别是 血干细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞等多种细胞的表面。四种 00 据其与细胞膜的关系分为胞外区 (跨膜区 (胞内区 (部分 12。 种：分别是 13。 于细胞膜表面。个裂解位点，分别是 3位点，其中 须经过 3次裂解： （ 1） 1位点（ 1654位精氨酸残基和 1655位谷氨酸残基之间）裂解为胞外区（ 跨膜区（ 2个亚基，以非共价键（二硫键）连接在一起，形成异二聚体定位在细胞膜表面。 (2) 在 金属蛋白酶 (用下于 1710与缬氨酸 端和 个片段。 （ 3） 配体表达细胞吞噬，而 3位点（在跨膜区甘氨酸 1744之间）被 放 ，激活下游的靶基因，通过一系列级联反应，最后在转录水平调控细胞的生物学功能 14,15。所以抑制 16,17。 本 研究中，我们选择 过对 3进行干预，用 不同 浓度 的 外培养的人胃癌细胞株 应 用实时荧光定量 分析胃癌细胞株 探讨 能 机制 ， 为下一步的实验奠定了基础。相信 通过我们的研究， 将有助于揭示 在胃癌侵袭转移中的 分子机制，以利于找到新的预防和治疗以及未来的分子靶向治疗胃癌的途径 。 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 3 - 材料与方法 1 材料 胃癌细胞株 人胃癌细胞株 购于 中国科学院上海生命科学研究院 主要试剂 养基 司 细胞培养用新生牛 血清 杭州四季清公司 胰蛋白酶 司 司 司 引物设计、合成 司 T 司 司 解液 碧云天 脱脂奶粉 北京普利来公司 x 司 滤纸 上海生工 白定量试剂盒 北京普利来公司 司 兔抗人 克隆抗体 司 兔抗人 克隆抗体 杭州贤致 兔抗人 克隆抗体 司 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 抗 司 光液 司 过硫酸铵 （ 上海生工 丙烯 酰 胺 司 十二烷基硫酸钠 ( 上海生工 上海生工 蛋白 司 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 4 - 甘氨酸 上海生工 上海生工 上海生工 上海生工 微量 加 样器 上海生工 超纯水 兰州大学 第一医院 定影粉 北京中杉公司 显影粉 北京中杉公司 主要仪器 超净工作台 苏州净化 4 冰箱 20 冰箱 80冰箱 箱 日本三洋公司 光学倒置显微镜 日本 司 低温高速离心机 德国 司 500 型酶联免疫分析仪 美国 核酸蛋白定量仪 通用 公司 实时定量 ( 罗氏 诊断产品有限 公司 增 仪 ( 700 超纯水设备 色摇床 北京六一实验仪器厂 胶板 北京六一实验仪器厂 电泳仪 北京六一实验仪器厂 半干式电转移槽 北京六一 实验仪器厂 垂直电泳槽 北京六一实验仪器厂 电子天平 S 400S 移液器 日本立洋 主要溶液配制 细胞培养用 冲液 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 5 - 2O . 2g， 溶于 1000 高温 高压消毒 ， 4长期保存 。 250 50冲 液搅拌 30解后 ，用 装后 ， 20 避光保存。 胰蛋白酶 蛋白酶加入 100冲 液 中 ，用 整 用 分装， 4保存 。 超纯水按照说明配置，加入 100U/霉素 、 100U/霉素， 用整 右，过滤 用 分装， 4 保存备用。 细胞冻存液 生牛血清溶于 制成 1胞冻存液。 称取 于 90纯水 中，用 浓 相应值 后 ， 定容到 100高温 高压消毒 30温保存 。 称取 90纯水溶 解，用 浓 相应值 后 ， 定容到 100高温 高压消毒 30温保存 。 称取 180纯水溶 解，用 浓 相应值 后 ， 定容 到 200高温 高压消毒 30温保存 。 10 8g， 200分溶解在超纯水中后 ，最后 定容 到 10004 保存 ， 使用 前 将其稀释 10 倍。 10电泳缓冲液： 0g，甘氨酸 充分溶解在超纯水中后， 最后定容到 1000温保存 ， 使用 前 将其 稀释 10 倍。 2阳极缓冲液 I（ 称取 醇 100于超纯水 ，用 最后定容 到 500温保存 ， 使用时将其稀释 2 倍 。 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 6 - 2阳极缓冲液 醇 100溶于超纯水， 以 定容 到 500温保存 ， 使用时将其稀释 2 倍 。 4阴极缓冲液（ 氨酸 6g，甲醇 200于超纯水， 以 定容 到 500温保存 ， 使用时将其稀释 4 倍 。 5 5L 甘油 2.5 芬蓝 25用 超纯水定 容 至 5分振荡混匀后，分装于 心 管中， 4 保存。 封闭液 （ 5%脱脂奶粉） ： 将 脂奶粉溶于 10 ，现用现配。 抗体溶液： 将一抗、二抗按一定的稀释比例加入 新鲜配制 5%脱脂奶粉中 。 10 丽春红染液： 将 丽春红 2g，磺基水杨酸 30g，三氯乙酸 30g， 溶解 于 100纯水中，使用时将其稀释 10 倍。 定影液： 将定影药粉 中小包 溶解于 10005 温水中，待全溶 透明后加入大包药粉搅拌，充分溶解后，定容到 ，待冷却至室温后使用 。 显影液： 将 显 影药粉 中小包 溶解于 10005 温水中，待全溶 透明后加入大包药粉搅拌，充分溶解后，定容到 ，待冷 却至室温后使用 。 10%将 10g 解于 100纯水， 50 水浴下溶解，室温保存。 10%过硫酸胺（ 硫酸胺 , 溶于 1纯水 中 ， 4 保存，保存时间为 7 天 。 理水： 量取超纯水 100 合均匀后， 高温 高压消毒 30然冷却后， 4 储存备用。 0)： 将 10丙醇中，溶解后，分装在 心管中， 20保存。 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 7 - 2 方法 细胞培养 人胃癌 细胞 株 含 10%新生牛血清、 链 霉素 (100U/青霉素(100U/ 养液中， 37 ， 5% 95%空气 细胞培养箱内常规 培养。 胞传代 代前准备 （ 1） 培养用液 的 预热：把已经配制好的装有培养液、胰蛋白酶和 冲液的瓶子放入 37 水浴锅内预热。 （ 2） 用 75%酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台。 （ 3） 正确摆放使用的器械：保证足够 有效 的操作空间，不仅 方便 操作而且能够 减少污染。 （ 4） 点燃酒精灯：注意 酒精灯内酒精不得超过酒精灯最大容量的 2/3， 酒精灯火焰不能太小。 （ 5） 准备好 实验中要 用的 经过 消毒的空培养瓶 。 （ 6）将 预热好的培养用液取出： 将 已经预热好的培养用液取出，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净 工作 台内。 （ 7）将 细胞 从 培养箱内取出：注意细胞取出时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面 后， 在镜下观察细胞。 （ 8） 打开瓶口：将细胞培养瓶放入超净 工作 台内，将各瓶口 依次 打开， 同时要在酒精灯上消毒 瓶口。 蛋白酶消化 （ 1） 加入 胰蛋白酶 ： 先将瓶内旧 培养 液 小心倒出 ，用 洗 2 3 次后 ，加入 化液（ 胰蛋白酶 ） ， 轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。注意消化液的量以盖住细胞最好，消化最佳温度是 37 。 （ 2） 显微镜下观察细胞： 消化 2 5，将培养瓶瓶盖旋紧后置于 倒置显微镜下 进行 观察 。 若 发现细 胞质回缩，细胞之间 间隙增大 ， 应立即终止消化，进行下一步操作 。 （ 3） 倒出消化液 加入培养液：弃去胰蛋白酶液，加入含 10%新生小牛血清的 新鲜培养液 ，终止消化 。 打分散细胞 用吸管将消化 后的 细胞吹打成细胞悬液， 将 细胞悬液加入到 10 心管兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 8 - 中。 用天平配平 后 ， 将离心管放入台式离心机中，以 1000 心 5倒出上清 液 ，加入培养液适量，轻轻用滴管吹打细胞制成细胞悬液。 装 稀释 细胞 （ 1） 分装： 用滴管 将细胞悬液吸出 ， 分装至 2 3 个培养瓶中，加入 8 旋紧瓶盖。 （ 2） 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞 数 ，必要 时 计数 ， 并标记好时间、 操作者 和细胞名称。注意密度过小会影响传代细胞的生长， 所以 传代细胞的密度不应低于 5105/ 续培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 37， 5%胞 培养箱中继续 常规 培养。 细胞的冻存 冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冰冻时，细胞内外的水分会快速形成冰晶，冰晶的形成会对细胞造成损害，甚至引起细胞死亡。 （ 1） 取 处于对数生长期， 生长状态好的细胞 用胰蛋白酶消化 制成 单 细胞悬液 。 （ 2） 1000 5心 ，用 冲液 洗涤 。 （ 3） 加入 配置好的含 10%细胞 冻存液中， 冻存液中 细胞 的最 终密度为 （ 5 10） 106/ （ 4） 用吸管轻轻吹打 使细胞 均匀，然后分装入 无 菌冻存管中，每 只冻存 管加液 1 （ 5） 旋紧密封 冻存管， 管上 写明细胞 的 名 称和冻存时间 ，装入已作标记的小袋 。 （ 6） 先放入 4 冰箱 40着置于 20 冰箱，约 30 60置于 80 超低温冰箱中放置过夜，最后 移入 液氮罐中长期保存。 细胞的复苏 细胞复苏的原则 是 快速融化：必须将冻存的细胞快速融化至 37 ，使细胞外冻存时的冰晶 在很短的时间即 融化，避免 由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内结晶 对细胞造成损害。 （ 1）提前 打开水浴锅，温度调 节为 37 ，待温度 稳定到 37 后， 将细胞冻存管从液氮中取出， 直接 放入 37 水浴中 轻轻 摇动 ，使 冻存管 内容尽 快融化 。 （ 2）从 37 水浴中取出冻存管， 用吸管 吸出细胞悬液， 移入 10心管中，加入 3养液， 混合后 1000离心 5出离心管，兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 9 - 弃 去上清 液 。 （ 3） 用吸管再加入 6养液，轻轻吹打将细胞悬浮， 1000心 5出离心管 ， 弃上清 。 （ 4）用吸管加入 2 10%新生牛血清的 养液，轻轻吹打将细胞悬浮， 再将管内液体移入己加 6 10%新生牛血清的 养液的 75养瓶中。 （ 5） 将 胃 癌细胞 株置 于 37 ， 5% 95%空气 细胞培养箱中静置 培养。 （ 6） 隔夜，将培养瓶放置在显微镜下观察，可见培养瓶中大部分细胞均己贴壁，呈不规则形状 ，说明复苏成功，更换一次培养液，继续培养。 细胞计数 实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作 （ 1） 准备工作 取一瓶传代 培养 的细胞，按照细胞培养中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以 备 使用。 用 95%乙醇清洁计数板和专用盖玻片，然后用纱布 轻轻拭干。 （ 2） 制备细胞悬液 将 细胞用 胰蛋白酶液消化、 洗涤后，加入 适量 培养液，吹打制成待测细胞悬液 ，要求细胞密度不低于 104/ （ 3） 加样 A盖好盖玻片 ：将经过清洁的 盖玻片盖在血球计数槽上。 B制备计数用的细胞悬液：用吸管吸 5 滴细胞悬液到离心管中，加入 5滴台盼蓝染液（ 或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 C将细胞悬液滴入计数板： 用吸管轻轻吹打细胞悬液使其均匀 ，然后吸取少量 细胞 悬液沿盖玻片 一侧 边缘缓缓滴入 （加样时不能溢出盖玻 片，也不能流入旁边槽中，加样量不能过少，盖玻片下不能有气泡，否则要重新加样） 。 （ 4） 计数细胞 统计四个大格的细胞数 目 ：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察， 边观察边 移动计数板，当镜中出现计数方格后，数出四角的 4 个大格（每个大格含有 16 个中格）中没有被染液染上色的细胞数目（只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按 1 个计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左 线，不计 右 线）。 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 10 - （ 5）计算细胞数 计算原细胞悬液的细胞数： 将计数结果代入 下面公式计算细胞密度：细胞数 / 4 个大格子细胞数 之和 /4） 2104 说明：公式中乘以 104是 因为计数板中每一个大格的体积为： ） ） ） 而 11000式中除以 4 是 因为计数了 4 个大格的细胞数。 公式中乘以 2 是 因为细胞悬液与染液是 1 1 稀释。 细胞计数要点 （ 1） 进行细胞计数时，悬液中细胞数目不低于 104 个 /果细胞数目过少，需离心后再重悬细胞于少量培养液中。 （ 2）消化单层细胞时， 细胞要分散良好， 制成单细胞悬液， 否则会影响 细胞 计数的准确性。 （ 3） 每次取样 计 数 前，应充分混匀细胞悬液 。在连续取样计数时， 更要注意每次取样都要混匀，否则计数结果会有很大误差。 配药 ： (2S)-(3,5 药物 子量为： 电子天平称取 于 （终浓度为： 10000 ），分装于 200L 中， 80 储存备用。 计算肿瘤细胞存活率 实验原理 验即四唑盐比色试验，是一种检测细胞存活和生长的方法。实 验用四唑盐化学名为 3-（ 4,52） 品名为噻唑兰，简称 细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 原为不溶性的蓝紫色结晶物甲 臜 （ 并沉积在细胞中， 而死细胞无此功能。 甲 臜溶解于二甲基亚砜（ 用酶联免疫检测仪在 490长处测量其光吸收值， 根据测得的吸光度值（ ） ，可间接反映细胞数量。 实验分组 （ 1）空白对照组：不接种细胞，不加入干预药物，只加入溶剂，作比色调零孔； （ 2）阴性对照组：接种人胃癌细胞株 加干预药物处理； 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 11 - （ 3）实验组：加 预组， 浓度按 5 、 10 、 20 、 40 、 60 分为 5 组，分别 在 37 ， 5%胞培养箱 中培养 24、 48、 72 h。每个浓度设 3 个平行孔。 实验步骤 （ 1） 取处于对数生长期的 胃癌 细胞株，用 胰蛋白酶消化，用含 10%新生牛血清的 养液制成单细胞悬液。 （ 2） 用计数板计数 细胞 后接种于 96 孔培养板，用含 10%新生牛血清的养液重悬细胞使细胞数为 1104 个 /孔加入细胞悬液200L，待细胞贴壁后加入干预药物。 （ 3） 按照上述实验分组进行加 预 。 （ 4） 弃去培养上清液换无血清培养基， 用加样器 每孔加入 20L 液 ，37 继续 孵育 4 h，终止培养， 小心 弃去 孔内 培养上清液，每孔加入 150L 振荡 10结晶物充分溶解。 （ 5） 在酶联免疫检测仪 上选择波长 490各孔的 光吸收值 ，记录结果。 结果分析 取每 3 个平行孔 的平均数， 计算 癌 细胞存活率。 细胞存活率 =(实验组 空白对照组 )/(阴性对照组空白对照组 )100% 实时荧光定量 验 实验原理 实时荧光定量 术，指 的 是在 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料， 我们采用的是 光染料 ， 就是 在 应体系中，加入过量 光染料， 光染料特异性地掺入 链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 物的增加完全同步。 引物设计与合成 下述 引物由 司设计，上海英骏生物技术有限公司 (司 )合成。 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 12 - 物序列 表 1 引物序列 基因名称及引物序列 上游引 物： 5- 3 下游引物： 5- 游引物： 53 下游引物： 53 游引物： 5下游引物： 53 引物配制 （ 1） 确定引物量 ： 即合成引物 例如其读 数 为 。 （ 2） 配置储存液 ： 将储存液浓度配制为 100 ( 此时加入 理水的量为 10=。 （ 3） 配置工作液 ： 取引物储存液 1 份加 9 份 理水，配制成 10 的工作液。 注意 ：在溶 理 水之前 应 先将装引物的 离心一下再打开 管 盖，以 防引物丢失。 实验分组 剂量依赖性检测 癌 细胞株 不作任何处理，作为对照组。 实验组 在 癌 细胞株 中 加入 浓度分别为： 5 、10、 20 、 40 ； 分别作用 24 h，重复 3 次 。 时间依赖性检测 癌细胞株不作任何处理，作为对照组。 实验组 在 癌 细胞株中 加 入终 浓度为 20 别作用24、 48、 72 h，重复 3 次。 细胞处理 接种细胞于 单孔 细胞培养皿 中 ，细胞长至 60%左右时，同步化处理细胞 （ 即用无血清 养液继续培养 24 h，以使所有细胞处于同一生长期 ） ，然兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 13 - 后按照 上述 分组加药处理细胞。药物终浓度为 5 加 2L 干预药物， 10 加 4L 干预药物， 20 加 8L 干预药物 , 40 加 16L 干预药物。总体系： 4 提取 理 一种新型总 提试剂，试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可 迅速 裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 蛋白质分离，并将 放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 入水相，离心后可形成水 相层和有机层，这样 仍留在有机相中的蛋白质和 离开。水相层（无色）主要为 机层（黄色）主要为 蛋白质。 操作前准备 使用前， 准备 75%乙醇（ 、 氯仿、异丙醇 、 P 管（ 、 无 水。 细胞中总 提取 （ 1） 将 单孔细胞培养皿 中的培养液吸入到无 体过多可同时倒入多个离心管中收集）， 1000 心 5去上清，加入1洗涤，然后 1000 离心 5去上清后用 次，吸去上清。 （ 2） 在离心管中加入 150L 震荡器上震荡混匀，直到肉眼看不见细胞团为止。 （ 3） 单孔细胞培养皿 中用无菌 洗 2 次 ， 弃上清后加入 1移液器吹打以 使 细胞充分裂解， 室温裂解 5然后将 液体吸入 上述离心管中 （尽量在冰上进行整个操作） 。 （ 4） 加入氯仿 200L， 震荡器上 剧烈振荡 15 温放置 3 （ 5） 12000 4 离心 15 离心机小心取出离心管，此时样品分为 3 层，即无色的上清液 、中间的白色蛋白层及 下层的有机相， 上 清液中 。 （ 6） 小心 吸取上清液（切记不要吸取任何中间层物质）到新的 入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温放置 10 （ 7） 120004 离心 10管底部可出现沉淀。 （ 8） 弃上清， 加入 1 5%乙醇洗涤沉淀。 12000 4离心 5 去上清。室温干燥 5 10 （ 9） 根据 ， 加入 20 50L 分溶解 州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 14 - 将得到的 80 保存或用于扩增试验。 本的定量分析 用核酸蛋白定量仪测出 浓度及纯度） ， 80 在 若比值小于 明有残余蛋白质，则该份 合成 剂盒组成成分 试剂盒组成成分见表 2（ 10 L 反应 200 次）： 表 2 T 00 L T 100 L 50 M） 100 L 100 M） 400 L 反转录 （ 1） 冰上配制 应液（见表 3）： 表 3 应液体系 试剂 使用量 (L) 5 4 12 20 （ 2）每 10L 反转录体系加入的 量不超过 500 转录前应按照测得的 适度适当稀释 品。 （ 3） 反转录反应条件： 37 15 转录反应） 85 5 转录酶的失活反应） （ 4） 将反 转率得到的 80 保存备用 ，或者直接进入下一步扩增。 兰州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 15 - 实时荧光定量 应 冰上 配制 应液 ， 见表 4 表 4 应液体系 试剂 使用量 (L) 终浓度 x T 反应液（ 液） 2 菌蒸馏水） 5 应条件 95 10 1 5 5 62 30 实验结果分析 （ 1） 反应结束后分析 熔解 曲线，由 熔解 曲线判定扩增产物是否单一，确认产物的特异性。 （ 2） 数据分析： 法 目前 ， 采用实时荧光定量 对定量 ， 国际上通用的比较目的基因在不同组织中表达差异的方法是 2 原理： 与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（ 含义是 需要的循环数）。每个标本重复 2 次，取平均值为 。首先，将目的基因 ( 用内源性表达的基因 (进行归一化 ( T 分别获得实验样品 (对照样品 ( ， 即 CT CT CT CT 然后，计算实验样品与对照样品的 值，即 CT CT 最后 ， 计算样品 中 目的基因的相对表达率 (， 2 未做任何处理的 癌 细胞中各指标 (基因表达量为 1， 2 40 州大学硕士研究生学位论文 胃癌细胞株 控 达的研究 - 16 - 验 实验原理 用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “ 探针 ”是抗体，用标记的二抗 “ 显色 ” 。经过 离的蛋白质 样品，转移到固相载体（硝酸纤维素膜 ）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 实验分组 量依赖性检测： 入 终 浓度分别为： 5 、 10 、 20 、 40 。 胞 不做任何处理，作为对照组。 分别作用 24 h，重复 3 次。 间依赖性检测： 入 度为 20 。 做任何处理，作为对照组。 分别作用 24、 48、 72 h，重复 3 次。 具体操作 胞处理 将人胃癌细胞株 种于单孔培养皿中 待细胞长至 60% 左右时，同步化处理细胞 （ 即用无血清 养液继续培养 24h，以使所有细胞处于同一生长期 ）， 然后按照以上分组加 药处理细胞。药物终浓度为 5 加干预药物 2L， 10 加干预药物 4L， 20 加干预药物 8L, 40 加干预药物 16L。总体系： 4 白样品的制备 （ 1） 将培养液 吸 入无菌的离心管（因为加入药物后会影响细胞的贴壁，一些活细胞可能会脱落入培养液中，所以同时需要收集培养液中细胞），然后将培养 皿中的培养液吸干净 。 （ 2） 每 个培养皿 加 3 预冷的 平放轻轻摇动洗涤细胞，然后弃去 复以上操作 2次，