【毕业学位论文】（Word原稿）嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株抗菌代谢物质的分离及结构鉴定微生物学硕士论文

密级： 秘 密 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 嗜线虫致病杆菌北京变种 株抗菌代谢 物质的分离及结构鉴定 of I 目 录 目 录 . I 摘 要 . . V 第一章 绪论 . 1 究目的和意义 . 1 用抗生素研究现状 . 2 用抗生素发展概况 . 2 用抗生素的种 类 . 3 病杆菌抗菌代谢产物研究 . 5 病杆菌（ 介 . 5 病杆菌代谢物的抑菌活性 . 6 病杆菌的抗菌代谢物质 . 7 究内容和方法 . 10 究内容 . 10 究方法和技术路线 . 10 第二章 嗜线虫致病杆菌北京变种 . 11 验材料 . 11 试菌株 . 11 养基 . 11 剂 . 11 验仪器 . 11 株发酵培养 . 12 酵液预处理 . 12 示菌的筛选 . 12 同温度下酸碱稳定性测定 . 12 性测定 . 12 离性测定 . 13 果与分析 . 13 示菌的筛选 . 13 稳定性和酸碱稳定性测定 . 15 性测定 . 16 电泳 . 17 结 . 17 三章 抗菌代谢物质大孔树脂吸附提取技术探索 . 19 验材料 . 19 验仪器 . 19 验方法 . 19 酵液预处理 . 19 孔吸附树脂的预处理 . 19 孔吸附树脂的选择 . 20 佳吸附 的确定： . 20 态吸附效果测定 . 20 脱条件的确定 . 20 果与分析 . 21 孔吸附树脂的筛选 . 21 佳吸附 的确定 . 21 孔吸附树脂柱动态吸附效率测定 . 22 酮水梯度洗脱 . 23 酮水用 化后梯度洗脱 . 23 脱放大实验 . 23 结 . 24 第四章 抗菌代谢物质的分离、纯化 . 25 验材料 . 25 验仪器 . 25 验方法 . 25 10 阳离子树脂交换柱层析 . 25 度分析 . 26 离子树脂柱层析 . 26 度分析 . 27 果与分析 . 27 10 离子交换树脂交换能力 . 27 脱效果 . 27 度检测 . 28 离子树脂柱层析 . 29 度检测 . 29 结 . 30 第五章 抗菌代谢物质结构鉴定 . 31 验仪器和试剂 . 31 验方法 . 31 果与分析 . 31 分结构分析 . 31 分结构分析 . 32 结 . 33 第六章 生物活性测定 . 34 验材料 . 34 验试剂 . 35 要实验仪器 . 35 验方法 . 35 果与分析 . 35 植物病原真菌的抗菌谱测定 . 35 苎麻 疫霉病菌的抑制作用 . 36 黄瓜疫霉病菌的抑制作用 . 37 辣椒疫霉病菌的抑制作用 . 37 草莓疫病菌的抑制作 用 . 38 苹果斑点落叶病菌抑制作用 . 39 苹果轮纹病菌的抑制作用 . 39 结 . 40 结论与讨论 . 41 参考文献 . 43 附 录 . 48 致谢 . 54 作者简历 . 55 要 嗜线虫致病杆菌北京变种（ 肠道内的共生细菌，研究表明，其代谢产物对植物疫霉病菌等多种真菌有很好的抑制作用，分离纯化其抗菌活性成分，鉴定 其分子结构，对研究该菌的抑菌作用机理，研制拥有自主知识产权的新型生物农药具有重要指导意义。 本研究测定了北京变种 定了抗菌物质的分离提取技术路线，获得了两种组分，并进行了结构鉴定和抗菌谱测定。主要结果如下： 1. 确定了以枯草芽孢杆菌代替黄瓜疫霉病菌作为抗菌物质分离提取过程中的指示菌。 2. 测定了北京变种 株抗菌代谢产物在不同 温度组合下的稳定性，明确了抗菌物质在 28或 80条件下， 26 时比较稳定， 于 8 时不稳定。在 件下 212 时，抗菌物质均比 较稳定。 3. 测定了抗菌物质的极性和带电荷性。纸层析和纸电泳试验结果表明发酵液中主要抗菌物质为水溶性、碱性抗生素，在水溶液中带正电荷。 4. 筛选出吸附效果较好的大孔吸附树脂 对抗菌物质的吸附率达 95%以上；筛选出 30%的丙酮溶液内加 最佳洗脱溶剂。 5. 确定了离子交换层析方法，对抗菌物质进行分离纯化，获得两种抗菌物质组分，分别命名为 测，其纯度均达 99%以上。 6. 测定了抗菌物质的红外、紫外吸收光谱、质谱和 113C ，分析鉴定出两种抗菌物质的化学结 构，均为异香豆素类衍生物。 7. 测定了 分的抗菌谱。 黄瓜疫霉病菌、苎麻疫霉病菌、 草莓疫病菌、 辣椒疫霉病菌的 外，对 西葫芦灰霉病菌、 苹果 斑点落叶病菌，也有较好抑制作用。 本文的研究成果为新农用抗生素 进一步产业化奠定了基础，为今后研究其作用机理、测定构效关系、安全性、以及优化分子结构，开发一系列新的高效农用抗生素提供了必要条件。 关键词：嗜线虫致病杆菌、抗菌物质、分离、结构鉴定 V is a It is to of of of of as 1. is to as an 2. of in at 8 0 , in ; it to in 2. 20 , to of 8h. 3. 4. -5 to 5%. of in -5 as 30%) 5. to of is to be 9% by 13C to 7. of ml of of on of of so as to a of 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究目的和意义 生物农药的研究与开发是现代农业高技术发展的重要研究领域， 许多发达国家积极支持生物农药的研究与开发，国际大企业集团纷纷投巨资进行技术开发和商品化生产，以期在国际竞争中占据制高点。中国是一个农业大国，每年由于农作物病虫害造成的经济损失达 15% 25，为了挽回损失而大量使用化学农药，导致人类赖以生存的生态环境遭到了严重的破坏，尤其是农产品农药残留超标，严重威胁着人类的健康，阻碍了我国农产品的出口创汇能力。生物农药是实现农产品安全生产、环境友好的重要保障，已列入 21 世纪优先 发展领域。特别是我国加入 人民生活水平的不断提高，对绿色农产品的生产提出了更高的要求，因此发展生物农药对 实现高效、优质农产品具有重要的意义。 农用抗生素是生物农药的重要组成部分，我国农用抗生素年产量约 8 万吨，年应用面积达 3专家预测，到 2005 年，我国各类生物农药总需求可望达到 吨，其中，农用抗生素类 10 万吨，未来农用抗生素发展潜力巨大。 疫霉菌 (一类重要的植物病原菌，其寄主范围广，破坏性强，危害大。长期以来，控制疫霉菌所致病害一直较困难，尽管选育和推 广抗病品种是防治疫病的基本措施，但由于病原生理小种变异频繁，导致抗病品种的抗性很快丧失，目前仍无理想的抗病品种可以在生产上使用（ 1960；王源超 , 1994； 1983）。化学农药是防治植物疫霉病害的主要措施，但化学农药造成的环境污染已引起人们的关注，同时，抗性突变菌的频繁产生，对单一有效化学药剂极易产生抗性，导致防治效果快速下降或丧失，因此寻找和研制新的防治疫霉病的生物农药，丰富农药种类，实为当前植保所需。 致病杆菌（ 谢物在防治植物疫霉病害方面展示 了良好的应用前景，（ 1995）从伯氏致病杆菌 X. 发酵液中分离到吲哚（ 生物，在含毒平板上 50100 g 浓度下即可抑制致病疫霉 (丝的生长，且对不同生理小种均有抑菌活性。 1997）的研究也表明， 室内用该菌代谢物的 乙酸乙酯 粗提物 0.1 mg 能有效抑制马铃薯晚疫病菌的生长， 在 5.0 mg 浓度下，能减轻盆栽马铃薯晚疫病害 24%；在田间 10 mg 用 7 天后，能明显抑制枯叶的继续发展。 中国农科院生防所率先在国内开展了利用嗜线虫致病杆菌（ X. 谢物控制植物疫病的研究，并取得了显著效果。杨秀芬等（ 1998）测定了嗜线虫致病杆菌发酵液对 9 种病原细菌和植物病原真菌的抑制作用，发现对疫霉属的植物病原菌抑制作用最强。发酵液为 100L ，对苎麻疫霉的抑菌率均达 100%。发酵液浓度为 50100 L 对离体马铃薯叶片晚疫病有较强的控制作用，处理 7 天后控制病害分别达 100%（杨怀文等）；用 50 L 液作为保护剂处理盆栽植株叶片， 7 天后对晚疫病害控制率平均达 与 20 L 第一章 绪论 2 的 25%甲霜灵效果没有显著差异 ( =另外，发酵液对大豆疫霉菌、 白菜软腐病菌 、 水稻白叶枯病菌 等都有很好的抑菌效果（ 杨秀芬 等， 1998；杨怀文等， 2000； et 2001；杨秀芬等 2002）。 以上研究说明：嗜线虫致病杆菌发酵液对疫霉菌 (具有很好的抑制作用，有望研制开发出防治植物疫病的新型生物杀菌剂。由于目前该菌产生的抗菌代谢物质尚不清楚，限制 了研制开发的进程。本研究以疫霉菌为靶标，分离、纯化发酵液中抗菌物质，鉴定其分子结构，可为研究其抑菌作用机理，菌株改良、发酵代谢控制研究，以及对它的安全性及对环境的影响研究奠定基础，对研制开发新型生物农药具有重要意义。同时通过构效关系的研究，可为开发系列新的高效农药提供先导化合物。 用抗生素 研究现状 用抗生素发展概况 抗生素 (由微生物、植物、动物产生，或由化学方法合成或半合成的一大类有机物质的总称，它们在极低的浓度下，通过生物化学作用，能够抑制某些其他生物的生长或 代谢活动，甚至致死，而对产生者本身没有影响或影响甚微（顾觉奋 , 2001）。抗生素的 研究始于 1877年巴斯德 (现 具有拮抗 作用的微生物 ， 1928 年弗莱明（ 发现青霉素 并 工业化生产和 1944 年瓦克斯曼（ 土壤中发现了链霉菌产生的 链霉素 ，开始了 抗生素研究的黄金时代， 此后陆续发现了抗 G+细菌、抗病毒的广谱抗生素，如氯霉素、金霉素和土霉素 (1946 1950 年 )，抗真菌的制霉菌素，对青霉素耐药菌有效的红霉素及抗癌抗生素丝裂霉素C(1956 年 )等。当前世界各国的 抗生素种类逐年增加，全世界发现的抗生素已超过 1 万种；在天然抗生素不断工业化的同时，由于耐药菌株的出现，也促进了合成、半合成抗生素的迅速发展；自 1949 年首次合成氯霉素以来 ， 在上市的新抗生素中，合成、半合成抗生素所占比率逐年上升，由 50 年代的 10%， 60 年代增至 50%， 80 年代高达 90%，并一直保持上升趋势（邬行彦等， 1982；张致平， 1996）。 抗生素在防治人类疾病取得 重大 成就 的同时，也有效地 推动了 其在 农 业上的应用研究。抗生素类农药与化学农药相比，具有活性高，用量少，选择性强，对天敌影响小，易被其它的生物 或自然因素所分解，对环境污染少等优点，符合现代农业生产的要求。早期的农用抗生素研究主要集中在医用抗生素的农用上，最早在农业上大面积应用的医用抗生素有链霉素、土霉素及其混用的“农霉素”等（ et 1960； 1960）。它们对苹果、梨、柑桔、蔬菜等植物细菌性病害有特效。 由于医药用抗生素大都只能防治一些细菌性病害，对占植物病害 90%以上真菌性病害防效甚微；而且医药用抗生素在果蔬上普遍使用，可能会导致人体病原菌产生耐药性等问题。因此，针对植物病虫害研制安全、防效稳定的新型农业专用抗生 素非常必要。从 20世纪 50年代开始，全世界有不少国家以防治农业病、虫害等为主要目的，进行抗生素的筛选，致力于农用抗生素的研制，并且其研究领域逐渐扩展到 杀虫、除草 、 抗病毒 、保鲜、饲料添加剂、植物生长调节剂等 的应用上，农用抗生素的研究至今方兴未艾。（许文思等 , 1982；张曦等， 1998；沈寅初， 1996）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 用抗生素的种类 (1) 杀虫抗生素 利用抗生素防治农业害虫始于 50年代， 1950）首次报道了抗霉素 杀虫抗生素的发展是伴随着人们对化学农药引起的环境污染等公害以及虫害对 农药产生抗药性等的认识才逐渐受到重视而发展起来的。 60年代以后，开始筛选以杀虫为目的的新抗生素，相继出现出现紫莱霉素（ 密旋霉素（ 70年代又筛选出以四活菌素 (、米尔比霉素（ 代表的杀虫抗生素， 80年代杀虫抗生素逐渐成为热点，开发出有实用价值的潮霉素 B()、越霉素 B()、阿维菌素 (品种。我国有目的筛选杀虫抗生素的 工作开始于 70年代，相继问世的有浏阳霉素、韶关霉素和南昌霉素、梅岭霉素等。国内外报道的杀虫抗生素较多，现就研究开发比较成功的杀虫抗生素阐述如下： a) 杀粉蝶素（ 这一抗生素最早是由 1963）以家蚕为模式昆虫筛选出来的一种由链霉菌（ 生的抗生素，杀粉蝶素是触杀性毒剂，对家蚕、家蝇、粉蝶、叶螨和蚜虫有强烈的毒杀作用 (沈寅初 , 1984)。 b) 四活菌素（ 也称杀螨素，是日本 70年代以绿豆象为试验昆虫筛选出来的，螨类对它更敏感，四 活菌素作用于动物细胞膜，破坏细胞膜的正常功能，造成细胞内物质泄漏，导致机体死亡（谢立贵 , 1982）。 c) 阿维菌素 (阿