【毕业学位论文】（Word原稿）转基因水稻作为肉仔鸡日粮原料的安全性评价动物营养与饲料科学博士学位论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 转基因水稻作为肉仔鸡日粮原料 的安全性评价 I 摘 要 本论文通过 5 个试验 系统 研究了转基因糙米对肉仔鸡生 产 性能和肌肉 组 成、消化能力和健康状况、免疫功能和肠道微生物菌群的影响， 并 对饲喂转基因糙米肉仔鸡肌肉和组织中抗虫基因和抗虫蛋白进行了检测， 以便评价来自转 因抗虫水稻的糙米作为肉仔鸡饲料原料的安全性。本试验结果 表明 ， 转基因糙米 未 对肉仔鸡产生 明显的 不良 影响， 转基因成分在肉仔鸡体内 未见 残留 。可见， 试验期内转基因糙 米 作 肉仔鸡日粮原料 使用 是安全的。 试验 1、 转基因糙米营养成分及其对肉仔鸡生 产 性能和肌肉 组成的影响 本试验分两个部分：糙米营养成分分析和动物试验。 首先 ， 以非转基因的亲本糙米作为对照，对转基因糙米中的常规营养成分、氨基酸和矿物质含量进行了分析，结果表明转基因糙米中的粗蛋白含量较非转基因糙米低 17 种氨基酸和某些矿物元素含量也不同，可见转基因糙米与非转基因糙米在营养成分上没有实质等同性 ；然后 ， 以肉仔鸡为试验动物探讨了以转基因糙米作为 肉仔鸡日粮主要能量来源对肉仔鸡生产性能、屠宰性能和肌肉组成的影响。选用 320 只 8 d 母各半，分开饲养。按相同的方法分组，均随机分成 2 个处理组，每个处理 8 个重复，每个重复 10 只鸡， 对照组饲喂 非转基因糙米日粮（ ）， 试验组饲 喂 转基因糙米 日粮（ ），分两个阶段， 8 21 d 和 22 42 d。试验结果 表明 ： 8 21 d 公鸡和母鸡的两个处理组耗料量、体增重和饲料效率无 显著差异（ P 22 42 d 试验组公鸡和母鸡的生产性能均有优于对照组（ 对肉仔鸡胸肌进行近红外 光谱分析，波谱上未出现明显可分辨的差异性， 但 对波谱进行聚类分析后发现样品在聚类图上基本按组分成两部分，原因有待进一步分析。 本试验 表明，饲喂转基因糙米对肉仔鸡生产性能、屠宰性能和肌肉组成未产生可见的不良影响。 试验 2、 转基因糙米对肉仔鸡消化能力、血清生化指标和器官发育的影响 本试验旨在探讨以转基因糙米作为肉仔鸡日粮的主要能量来源对肉仔鸡 营养物质消化利用 、器官发育和某些血清 生化指标的影响。试验将 96 只 1 d 仔鸡随机 分成两个处理组， 每个处理 8 个重复，每个重复 6 只鸡（ 3 只公鸡， 3 只母鸡）， 对照组饲喂非转基因 糙米 日粮（ ），试验组饲喂转基因糙米 日粮（ ） 。 试验期 42 d，分两个阶段， 1 21 d 和 22 42 d。 18 21 9 42 d 时饲料中添加 为指示剂， 收集粪便， 测定饲料中的粗蛋白、氨基酸、钙、磷的表观消化率和表观代谢能。 42 d 时每个重复随机抽取 1 只肉仔鸡，心脏采血制备血清，测定谷草转氨酶等酶活性、尿酸和甲状腺激素含量；取血后屠宰，测定脏器和小肠的器官指数；其中肝脏、肾脏和脾脏做成显微切片观察病理变化，小肠各段做成切片测定绒毛长度和隐窝深度。试验结果表明：两个阶段饲料 中的蛋白质、氨基酸、钙、磷的表观消化率和表观代谢能在两个处理组之间均无显著差异（ P两个处理组 42 d 血清的酶活、尿酸和甲状腺 激 素含量，器官指数及小肠绒毛长度和隐窝深度无显著差异（ P切片病理观察未发现明显的病理变化。这 表明试验期内转基因糙米对肉仔鸡的健康状况未产生可见的 不良 影响。 验 3、 转基因糙米对肉仔鸡免疫器官发育和免疫功能的影响 为研究转基因糙米对肉仔鸡免疫器官发育和免疫功能的影响， 本试验将 96 只 7 d 仔鸡随机 分成两个 处理 组， 对照 组饲喂非转基因糙米 日粮（ ） ， 试验 组饲喂转基因糙米 日粮（ 每组 48 只，设 8 个重复，每个重复 6 只（ 3 只公鸡， 3 只母鸡）。 试验期 42 d，两个阶段饲喂。分别测定了肉仔鸡 21 d 和 42 d 胸腺、脾脏和法氏囊的器官指数， 21 d 和 42 d 血清中溶菌酶含量、新城疫抗体滴度， 42 d 血清中球蛋白含量及外周血 T 淋巴细胞转化率。试验结果显示：饲喂 转基因糙米日粮肉仔鸡 21 d 和 42 d 免疫器官指数和饲喂 非转基因糙米日粮肉仔鸡 无 显著差异（ P两组肉仔鸡 21 d 和 42 d 血清中溶菌酶含量、新城疫抗体滴度 未见 显 著 差异（ P42 d 血清中球蛋白含量以及外周血 T 淋巴细胞转化率 无 显著差异（ P研究结果 表明， 在试验期内饲喂转基因糙米 未 对肉仔鸡免疫器官发育和免疫功能 产生明显的不良 影响。 试验 4、 转基因糙米 对 肉仔鸡肠道微生物区系的影响 动物肠道 内栖息着复杂多样的微生物区系，该区系对宿主的生长和健康具有重要 意义。为研究转基因糙米对肉仔鸡肠道微生物区系的影响，试验将 96 只 1 d 肉仔鸡随机分成两个处理组，每个处理组 48 只，分成 8 个重复，每个重复 6 只（ 3 只公鸡， 3 只母鸡）， 对照组饲喂非转基因糙米日粮（ ），试验组饲喂转基因糙米 日粮（ ） 。采用传统的微生物培养和 种方法，对肠道内的几种微生物的数量和优势菌的多样性进行了研究。 微生物 培养结果表明，试验组肉仔鸡回肠微生物数量高于对照组，其中需氧菌和乳酸杆菌数量达到差异显著水平（ 析 结果表明，饲喂 转基因糙米日粮对肉仔鸡回肠和盲肠中微生物种群数量上未产生明显 影响（ P， 各个肉仔鸡肠道中微生物种群类型既具有一定的相似性，又存在一定的差异性，但未出现特别异常的现象。 试验结果表明，饲喂转基因糙米 日 粮在试验期内对肉仔鸡肠道微生物区系未产生明显的 不良 影响。 试验 5、 转基因糙米中外源基因和外源蛋白质在肉仔鸡体内残留的检测 随着转基因植物在饲料中的应用，人们对转基因植物中重组 其表达的目的蛋白质是否会转移 到 动物产品中越来越关 注 。本试验以转 因的抗虫水稻的糙米配成日粮饲喂肉仔鸡， 42 d 时随机抽取 8 只，无菌条件下心脏取血，以肝素钠抗凝 ； 屠宰 ， 无菌条件下取肉仔鸡的肝脏、肾脏、脾脏、小肠各段、胸肌和腿肌。采用一对 因特异的引物 ，以转基因糙米中的 因的 559 段为 增体系和扩增条件的阳性对照，以肉仔鸡内源卵白蛋白基因 396 段为 取效果阳性对照， 对血液、器官和肌肉 行 增， 检测是否有 因 559 段残留或转移， 结果 表明未 扩增出该基因的特异性片段； 以转基因糙米、转基因糙米配制的肉仔鸡日粮为阳性对照， 采用 检测 肉仔鸡 肝脏、肾脏、脾脏 、小肠、胸肌 和 腿 肌 是否有 由 因 表达的抗虫蛋白 的残留或转移 ， 结果未 检测出 白 。 这表明 转基因糙米中的重组 其表达的目的蛋白质 未向 肉仔鸡 体内转移和累积 。 总之 ， 通过本 系列 研究发现以转基因糙米作为肉仔鸡 饲料 原料配制日粮，饲喂肉仔鸡后未产生不安全作用， 且未发现转基因成分 在肉仔鸡体内 会 发生转移和残留。因为肉仔鸡生长速度快，试验周期短，因此在短期内是安全的，但是 转基因糙米作为饲料原料的长期安全性 仍需 进一步研 。本研 究不但为转基因植物作为饲料原料的安全性评价 奠定了 一定 基础 ， 且 可 为 转基因 水稻作为人们食物的安全性 评价 提供 科学的借鉴 数据 ，因此具有很重要的意义。 关键词 ： 肉仔鸡，转基因水稻， 稻，安全性评价 to of as a in of on of in of no in . In , of It of of In , a 42-d to a Bt on or as Xs In 1 d, no in of on or P of of In 2 2 d, of t s of P on of of of no of it is of CA to or to in of it no to in . a a of in of 8 21 9 42 of at of no V (Pin of of in P No it no of on s . 42 in s on of of of 1 2 of in 2 of of no Pin of it no of on s . of on in by 6S Bt or Xs of . no in P 22 42 d 试验组公鸡和母鸡的 生产性能均有优于对照组（ 对肉仔鸡胸肌进行近红外光谱分析，波谱上未出现明显可分辨的差异性，但对波谱进行聚类分析后发现样品在聚类图上基本按组分成两部分，原因有待进一步分析。本试验表明，饲喂转基因糙米对肉仔鸡生产性能、屠宰性能和肌肉组成未产生可见的不良影响。 关键词： 稻，转基因水稻， 营养成分， 肉仔鸡，生 产 性能 1 前言 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约有 1/2 的人以水稻为主要食物。但水稻生长过程中 经常受到害虫的侵袭，造成水稻减产。近些年来生物技术的快速发展，出现了许多转基因作物，在抗病虫害和提高产量方面起了较大作用，缓解了世界日益增长的人口和日益减少的可耕地之间的矛盾。我国在转基因水稻研究方面达到了世界先进水平， 中国水稻所、中国农科院生物技术所、中国科学院遗传所 、浙江大学、华中农业大学、福建农业大学等单位相继育成了一批 具有抗病、抗虫和高营养品质特性的转基因水稻，正在进行环境释放。 转基因抗虫水稻 利用农杆菌介导法将 因导入粳稻品种秀水 110，并经多代选育而成 （舒庆尧等 , 1998；项友斌， 1999)。经研究该水稻对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟具有较好的抗性（王忠华等， 2000a；吴刚等 2001；王世贵等， 2003）。 中国农业科学院博士学位论文 第三章 试验研究 25 在我国南方地区，为了开辟新的饲料资源，有时会采用陈稻谷、糙米、稻米加工副产物、碎米或未成熟米代替玉米用于畜禽饲料。研究表明，用糙米代替 50% 100%饲料中的玉米饲喂猪和鸡，不影响猪和鸡的生产性能和产品品质，甚至表现出比玉米更好的效果（何瑞国等， 1999a；1999b； 2000；张石蕊等， 2000；田科雄等， 2002；吴东等， 2004；马艳凤等， 2004）。随着转基因水 稻的不断发展必将会有转基因水稻产品用于动物饲料，尽管 虫基因经过多年的应用研究，证明其表达产物对禽类和哺乳动物无 毒害作用，但在基因转化过程中或基因转化后，水稻可能产生某些人们非期望性状而对动物产生危害作用。所以转基因水稻产品用于饲料，对动物的生产性能是否产生直接或间接的非期望影响值得研究。 本试验以实质等同性原则为指导，以抗虫水稻品种“克螟稻 试验材料，以非转基因的亲本水稻秀水 110 作为对照，研究了 肉仔鸡生产性能、屠宰性能和肌肉组成的影响。 2 材料与方法 米营养成分分 析 验用水稻 转基因水稻 为转入了抗虫基因 因 表达苏云金芽孢杆菌（ 孢晶体蛋白的粳稻品种秀水 110（转基因品名为 非转基因亲本水稻 为 没有 进行任何转基因操作的与 10（ 。 两种水稻 2004 年种植于浙江省嘉兴农科院试验田，贮存和加工过程中严格 分开，避免任何可能的混合和污染，两种水稻加工成糙米粉碎后用于肉仔鸡日粮。 米营养成分分析 按饲料样品的采集方法（ 对转基因糙米和非转基因糙米分 别进行取样，粉碎后过 40 目筛，进行样品分析。 （ 1）常规营养成分分析：参照饲料分析及饲料质量检测技术（张丽英， 2003）中所述方法进行。 1）水分含量：将样品放在 105 烘箱中烘至恒重，样品的失重即代表水分的含量。 2）粗蛋白含量：采用凯氏半自动定氮仪进行滴定。 3）粗脂肪含量：以乙醚为提取剂进行索氏提取。 4）粗灰分含量：在 550灼烧后所得残渣即为粗灰分。 5） 粗纤维含量：采用酸碱法进行测定。 6）无氮浸出物含量 =1粗蛋白含量 粗灰分含量 （ 2）氨基酸含量的测定 ： 采用酸水解（ 6 盐酸， 110 水解 24 h）和 氧化水解（蛋氨酸、胱氨酸使用过氧甲酸进行氧化处理） 对两种糙米进行处理 ，使用氨基酸自动分析仪测定 17种氨基酸 含量 。 （ 3）矿物元素分析 1）钙和总磷含量：参照饲料分析及饲料质量检测技术（张丽英， 2003）中所述方法进行。中国农业科学院博士学位论文 第三章 试验研究 26 钙含量的测定采用高锰酸钾滴定法，磷含量的测定采用钼黄比色法。 2）采用火焰原子吸收法测定钾、钠、锰、镁、铁、铜、锌等矿物 元素 的含量，测定分别参照中华人民共和国国家标准 2397物中钾、钠的测定方法、 2396物中铁、镁、锰的测定方法、 5009. 13物中铜的测定方法、 5009. 14物中锌的测定方法所述方法进行。 （ 2）能量的测定 1）总能：采用氧弹式热量计测定。 2） 表观代谢能：参照饲料生物学评定技术（霍启光等 ， 1996）中 “鸡饲料表观代谢能测定技术规程 ”进行操作。选用 35 d 肉用仔公鸡 24 只，随机分成两组，每组 12 只，每 2 只为一个重复。饥饿 24 h 后，每只鸡强饲 50 g 粉碎的糙米，以 为指示剂，收集 48 h 粪便， 10%硫酸固定氨， 65 烘干 48 h 恒重，空气中放置，制成风干样品，测定其总能，按下式计算两种糙米的表观代谢能。 表观代谢能 = b 1/中： 德发主编， 2003）。 照中华人民共和国国家标准 14962品中铬的测定方法所述方法进行。 物试验 粮的配制 试验日粮的配制参照 中 华人民共和 国农业行业标准 33饲养标准中肉鸡营养需要 ， 根据测定的糙米中各种营养成分含量 配制 糙米 非转基因糙米配制的日粮为， 转基因糙米配制的日粮为 ，日粮组成及营养水平见表 3日粮种其他原料均为非转基因产品， 日粮以粉料形式饲喂。 验动物及分组 400 只 1 d 仔鸡，公母各半，分开饲养， 1 7 d 饲喂商品肉小鸡料。 7 d 时，分别从200 只公鸡挑选出体重相近、健康的肉小鸡 160 只，随机分成两个处理组，每个处理组 80 只，分成 8 个重复，每个重复 10 只鸡；试验组饲喂转基因糙米日粮（ ）；对照组饲喂 非转基因糙米日粮（ ） ，经分析两组鸡的平均体重 差异 不 显著（ P分别为 1.0 g 和 0.8 g （平均数 标准误， X ；母鸡也按相同 方法进行分组，体重差异 不 显著（ P分别为 0.3 g 和 1.1 g。采用 3 层立体笼养，各处理组均匀分布于人工控温的 肉仔 鸡舍内，饲养管理和免疫程序按 品肉鸡饲养管理手册进行，自由饮水，自由采食。整个试验期 35 d，分两个阶段， 8 21 d 和 22 42 d。 中国农业科学院博士学位论文 第三章 试验研究 27 表 3粮组成及营养水平 料 % 21d 2 42d 21d 2 42d 基因糙米 Bt 转基因糙米 Xs 豆粕 41%) 油 酸氢钙 粉 盐 物质预混料 生素预混料 化胆碱 养水平（计算值） 谢能 MJ/蛋白 % % 效磷 % 氨酸 % 氨酸 % 氨酸 +胱氨酸 % ： 1 提供的微量元素 （ mg/粮）：铜， 8；铁， 100；锌， 100；锰， 120；碘， ， 2 提供的微量元素（ mg/粮）：铜， 8；铁， 80；锌， 80；锰， 100；碘， 硒， 3 提供的维生素（每 粮含量）：维生素 A， 8000 生素 1000 生素 E， 20 生素 K，0.5 胺素， 2 黄素， 8 生素 3.5 生素 物素， 泛酸，10 酸， 35 酸， 4 提供的维生素（每 粮含量）：维生素 A， 6000 生素 750 生素 E， 10 生素 K，0.5 胺素， 2 黄素， 5 生素 3 生素 物素， 酸， 10 酸， 30 酸， 1mg/kg 8; 100; 100; 120; I, 2mg/kg 8; 80; 80; 100; I, 3of , 8000 3, 1000 , 20 , 0.5 2 8 3.5 12, 1035 4of , 6000 3, 750 , 10 , 0.5 2 5 3 12, 1030 中国农业科学院博士学位论文 第三章 试验研究 28 测指标与方法 产 性能 以各重复为单位记录 8 21 d、 22 42 d 及 8 42 d 的 耗料 量、阶段 体 增重，对死淘鸡只 耗料量进行校正后计算平均 耗料 量、平均 体 增重和饲料效率。公鸡和母鸡的数据分 别进行 统计。 体 性状及体组成 （ 1）屠体性状：于 42 d 时，从公鸡和母鸡每个处理组中随机抽取 4 只，共 16 只鸡，空腹称重，颈部放血处死，屠宰，测定屠宰率 ；并分离左部胸肌、左部腿肌和腹脂肪，参照家禽生产学（杨宁 ， 2002）计算有关指标。胸肌和腿肌称重后，置 冰箱保存备用。 全净膛率：屠宰 后去毛、头、脚和内脏后剩余的部分占活体重的比例。 胸肌率：取左侧胸肌称重，计算占活体重的比例。 腿肌率：取从股骨上端至胫骨末端的带骨的鸡腿为腿肉，计算占活体重的比例。 腹脂率：收集腹部脂肪（板油），腹部脂肪重占活体重的比例。 （ 2）肌肉组成分析： 冰箱保存的胸肌和腿肌在 4 冰箱中解冻， 取 50 g 左右相同部位的胸肌和腿肌测定其中干物质、蛋白和脂肪的含量，参照 实用食物营养成分分析手册（杨月欣等编， 2002）中所述的方法进行。 肌近红外光谱分析 样品处理 取 16 只鸡的 4 冰箱中 解冻 的胸肌样品，取相同部位 100 g 左右，组织匀浆机中 2000 碎 30 s。 光谱采集 搅碎的样品立即采 用 极管阵列近红外光谱仪，对供试样品进行扫描。波长范围 9501650 光谱收集速率 100 次 /s，试样采用旋转式扫描方式，每个样品重复装样 2 次，每次装样扫描 2 次。环境温度 2325 。 光谱比较 首先将收集到各样品的原始光谱图进行比较观察其相似性，然后采用机器自带软件对原始光谱图进行相应的预处理，即进行中心化处理（ 乘积分散校正法（ 标准正态变量转换法（ 标准化处理（ 与一阶、二阶（ 2， ）导数处理相结合对光谱进行预处理，以确定定性判别的可行性。 聚类分析 通过主成分分析方法（ 取经过预处理的光谱中的有效信息，对样品的光谱数据进行定性分析。 据的 统计 数据以平均数 标准误（ X 示。采用统计软件 中的 t 检验程序对数据进行差异显著性检验。生产 性能 数据公母鸡 分 别 进行统计分析，其他的指标数据合并进行统计分 析。 中国农业科学院博士学位论文 第三章 试验研究 29 3 结果与分析 米营养成分 米中常规营养成分和能 值 转基因糙米 非转基因糙米秀水 110 的常规营养成分和能 值见 表 3从表中可看出两种糙米中的常规营养成分除 粗 蛋白含量差异较大外，其他营养成分 和能 值 近似 。 转基因糙米中粗 蛋白 含量明显低于非转基因糙米 （ ，因为无氮浸出物 （ 含量 为 计算值，所以 原因需要进一步研究 。 表 3t 糙米和 米中常规营养成分和能 值 t s 养成分 s 糙米 Xs 米 Bt 糙米 分 % 蛋白 % 脂肪 % 纤维 % 灰分 % 氮浸出物 % 能 MJ/ 表观代谢能 MJ/： *数据来自 中国饲料数据库 。 *米中 氨基酸含量 和组成 转基因糙米和非转基因糙米中 17 种氨基酸含量 和组成见表 3表中数据可看出 转基因 糙米 和非转基因糙米 中各种氨基酸 的 含量 差异很大 ， 粗 蛋白 中氨基酸组成 除 谷氨酸、胱氨酸和脯氨酸差异较大外（含量之差接近或超过 1%），其他氨基酸 组成 基本相似 。 米中矿物元素含量分析 分析的矿物元素中包括 5 种常量元素（钙、磷、钾、钠、镁）和 4 种微量元素（锰、铜、铁、锌），常量元素中钾和镁含量差异较大，转基因糙米中钾的平均含量比非转基因糙米高 11.4 00g，而镁的含量则低 18.3 00g； 微量元素中铜和铁的含量差异较大，转基因糙米中这两种微量元素的含量均低于 非转基因 糙米。 中国农业科学院博士学位论文 第三章 试验研究 30 表 3t 糙米和 米中氨基 酸含量 t s 基酸 氨基酸 含量 in % 氨基酸组成 in % 米 Xs 米