【毕业学位论文】（Word原稿）罗格列酮对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量及SR-BI表达的影响

第一章 前 言 心血管疾病是当今世界威胁人类健康的最严重的疾病之一，主要包括冠心病、高血压、中风和外周血管病、它具有发病率高 (老年人发病率接近 45%)，死亡威胁大（死亡率 40%） 的特点，其发病率和死亡率已经超过肿瘤跃居世界第一。随着我国人民生活水平的提高以及随之而来的饮食结构和 饮食习惯的改变，心血管疾病目前已 经 占 到 全国总死亡人数的 1/2。如果不提高认识并采取有效的防治措施的话 ，长此以往 ， 到 2020 年我国心血管疾病死亡 人数 将再增加 50%。有研究预测，到 2020 年全球范围内由于心血管疾病造成的死亡数有 可能达到总死亡数的 36%。 动脉粥样硬化 (是一种慢性进 展性、系统 性 的 全身性疾病 1，是心 脑 血管疾病的病理基础，在此基础上 出现 斑块破裂、血栓形成， 甚至发生 血管闭塞 引发 不稳定型心绞痛、急性心肌梗死和猝死等急性冠脉综合征（ 2。 高血压、糖尿病、高胆固醇血症、肥胖、吸烟都是导致心血管疾病发生的重要的危险因素，在人们积极防治高血压的今天，脑出血事件 得 以 减少；相反对 于 胆固醇的重视和防治不够，高胆固醇血症引发 的心肌梗死发病率 则 显著上升，心血管疾病趋于年轻化 。 因此，寻求有效防治动脉粥样硬化发生 、 发展的途径已成为医学界研究的热点。 发生机制学说甚多， 主要有脂质浸润学说、血栓形成学说、内皮损伤反应学说、平滑肌克隆学说等。研究表 明 3，给动物饲喂富含胆固醇和脂肪的饮食可引起与人类动脉粥样硬化相似的血管病变。 泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的早期的最主要的病理特征， 低密度脂蛋白 (到氧化修饰是 生和进展的关键， 业已明确 动脉 管 壁中 氧化 低密度脂蛋白( 存在是造成动脉壁持续性损伤最重要的因素之一 4。 在血管内皮受损的情况下，血液中的单核细胞通过内皮间隙，在内膜下转化为巨噬细胞，巨噬细胞介导渗入血管内皮下的 生氧化修饰形成 巨噬细胞表面清道夫受体 （ （主要是 特异性 地 识别， 并 被无限制 地 摄取， 而且 受细胞内脂质浓度的负反馈 调节 5， 脂质大量进入细胞，加之胆固醇外流受阻，导致巨噬细胞内大量的胆固醇脂质蓄积，泡沫细胞形成 。 血脂异常是动脉粥样硬化发生的一个重要的危险 因素。 大量临床资料和流行病学资料显示，血浆高密度脂蛋白胆固醇（ 的水平与动脉粥样硬化的发 生和发展呈显著负相关。研究表明 6，高密度脂蛋白（ 抗动脉粥样硬化 的 最重要的作用机制是参与胆固醇的逆向转运（ 过程。 括动脉粥样斑块）转运到肝脏进行机体的再循环或以胆酸的形式排出体外，这一过程称作 固醇的逆向转 运过程包括促进 细胞胆固醇的流出，胆固醇酯化以及清除 三个过程 8。 持了细胞内胆固醇含量的稳定，降低了血浆胆固醇的水平，减少了泡沫细胞的形成，有利于延缓动脉粥样硬化的发生和发展过程 7。 酰基辅酶 A: 胆 固 醇 酰 基 转 移 酶 -1(: 细胞内已知 唯 一能够催化游离胆固醇与长链脂肪酸连接形成胆固醇酯的酶，是参与吸收、转运和储存胆固醇的一个极其重要的酶 9。要有两种表达形式，即 乎在各种组织和细胞中都有表达，主要作用是维持细胞内胆固醇的代谢平衡； 仅在肝脏和小肠细胞中表达，主要参与胆固醇的吸收和脂蛋白的装配。血液中的单核细胞分化为巨噬细胞后， 量表达，导致细胞内胆固醇酯的过量堆积而形成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化发病的最早期的变化。研究表明，泡沫细胞内脂滴的主要脂质成分是胆固醇酯，它是胆固醇的储存形式，是由 化产生的 11, 12。研究发现，在动脉粥样硬化病变的斑块中， 表达水平大大提高。在单核细胞向巨噬细胞转化的过程中， 表达量以及蛋白质的表达量都有显著的提高 13。研究表明，在动物和人动脉粥样硬化斑块中分离的泡沫细胞中，胆固醇酯合成速率及 活性也均大幅度的提高 10。因此，从理论上分析，泡沫细胞当中的大量胆固醇酯是由 化合成的。 B 族 I 型 清道夫受体（ , 是第一个在分子水平上证实的 体，能够与 高亲和力结合，参与 低密度脂蛋白胆固醇酯的选择性摄取。 1996 年， 过动物实验，第一次证实了 够选择性地介导胆固醇酯的吸收和转运 14。 多种组织和细胞中都有表达，如小肠、脂肪细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等；在 择性摄取的主要场所，即肝脏和 类固醇激素合成组织中也有高度表达 15。大量研究表明， 谢中具有十分重要的意义，它不仅仅介导细胞选择性地摄取 可以促进细胞内游离胆固醇的流出，防止游离胆固醇在动脉管壁中堆积。采用转基因小鼠和基因敲除的小鼠研究表明，表达能够减少粥样斑块的面 积，并且减少了动脉粥样硬化的发生，对动脉粥样硬化具有保护作用 16 。 位于细胞膜表面的 体，它参与胆固醇逆向转运、调节脂质代谢，是发挥抗动脉粥样硬化作用的重要受体之一 17。 过氧化物酶体增殖物激活受体（ 一种致密分子构成的类固醇受体，属于由配体激活的型核受体超家族成员 18， 有三种亚型： 来，随着研究的不断深入，发现 了参与脂质和脂蛋白的代谢， 调节 体内糖平衡之外，还涉及脂肪细胞、单核 /巨噬细胞等多种细胞的分化，抑制炎症因子的生成及炎症反应，影响肿瘤细胞的生长以及动脉粥样硬化的形成等等。在动脉粥样硬化形成的过程中， 单核 /巨噬细胞系的多种反应密切相关。 新型胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类（ 罗格列酮（ 吡格列酮（ 是 ，特异性强 19。 研究表明， 动剂 罗格列酮在伴或不伴糖尿病的情况下都有抗动脉粥样硬化的作用 20, 21。 研究发现 22，在几乎所有参与动脉粥样硬化形成的细胞如单核 /巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞当中都有 表达，在正常血管壁细胞当中虽然表达很少，但是在人或动物动 脉粥样硬化斑块当中都可以高亲和力的表达。 近来有关动物模型的数据显示动剂罗格列酮能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成，但其作用机制尚不明确 23,24。 本实验采用 激 噬细胞建立泡沫细胞模型，并用罗格列酮进行干预，罗格列酮组设立低、中、高剂量（ 5 ,10 ,20 ），目的是为了观察罗格列酮的作用是否呈现出浓度依赖性，采用油红 O 染色鉴定泡沫细胞模型的建立是否成功，采 用胆固醇氧化酶法检测泡沫细胞 总胆固醇含量、游离胆固醇含量、胆固醇酯含量，采用 术检测细胞 达的变化，以 此来总结罗格列酮是否通过降低泡沫细胞内胆固醇的含量、调节细胞 蛋白的表达来发挥抗动脉粥样硬化的作用，为临床防治冠心病提供理论依据。 第二章 材料与方法 1 材料 胞来源 核巨噬细胞购自中国科学院上 海细胞库 要试剂 糖型培养基 美国 司 （批号： 标准胎牛血清 杭州四季青生物公司 （批号： 罗格列酮粉 美国 司 （批号： 氧化低密度脂蛋白 广州奕源生物技术公司 （批号： 油红 O 粉 美国 司 （批号： 酶 美国 司 （批号： 美国 司 （批号： 总胆固醇检测试剂盒 北京普利莱生物公司 （批号： 游离胆固醇检测试剂盒 北京普利莱生物公司 （批号： 细胞蛋白提取 解液 美国 司 （批号： 白浓度测定试剂盒 美国 司 （批号： 23227） 兔抗人 体 美国 司 （批号： 兔抗人 体 美国 司 （批号： 兔抗人 体 美国 司 （批号： 体 上海丰翔生物公司 （批号： 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 上海丰翔生物公司 （批号： 剂 美国 司 （批号： 34077） 要器材、仪器及材料 飞鸽牌离心机 上海安亭科学仪器厂 电子天平 上海天平仪器厂 恒温水浴锅 北京西城区医疗仪器厂 倒置显微镜 日本 净工作台 苏州净化仪器厂 冰箱 青岛海尔股份有限公司 箱 美国 司 酶标仪 美国 司 超声波清洗机 宁波新芝生物科技有限公司 电热恒温水浴锅 成都红星电烘箱厂 手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海医疗器械厂 100 胞培养瓶 ,6 孔细胞培养板 ,96 孔细胞培养板 ,10 管 ,10 心管 ,1.5 存管 ,5 1 100 l、 10l 加样枪 , 5 1 100 l、 10 250 100 10 璃瓶，定性滤纸， m 孔径和 m 孔径定性滤膜，蔡氏滤器，酒精灯等。 胞培养 剂配制 糖型）培养基的配制 （ 1） 烧杯、磁力搅拌棒用蒸馏水冲洗干净，微孔滤膜浸泡在蒸馏水当中至少4 h（ 两张 22 m 孔滤膜放在下面，一张 45 m 滤膜 放在上面），蔡氏滤器冲洗干净后，加好滤膜，高压灭菌备用； （ 2） 电子称预热 30 ，准确称取 3.7 g 于烧杯中（容积为1000 ,加入 400 蒸水，用磁力搅拌棒搅拌，使 分溶解；再将 粉（ 13.4 g）倒入烧杯中，用双蒸水冲洗瓶内壁 2，最后用双蒸水定容至 1000 量瓶的容积为 1000 置于 4 冰箱过夜； （ 3） 第二日，超净工作台用紫外线照射 30 ，将前一天配好的 高压灭菌的蔡氏滤器过滤，分装于 250 口膜封好后，置于 4 冰箱储存备用。 双抗（青霉素、链霉素）的配置 （ 1） 取青霉素 160 万单位，用 3.2 蒸水溶解，吸出 2 入 100 量瓶当中； （ 2） 取 链霉素 100 万单位，用蒸馏水完全溶解后，全部吸出加入容量瓶中； （ 3） 用双蒸水定容至 100 （ 4） 超净工作台经紫外线照射 30 ，将配好的青、链霉素在超净工作台中过滤，分装于 10 小瓶中，封口膜封好后， 储存备用。 胎牛血清的灭活 （ 1） 将胎牛血清从 冰箱取出，置于 4 冰箱解冻； （ 2） 恒温水浴锅调节温度在 56 之间； （ 3） 将血清瓶置于水浴锅之中，以水没过血清平面为宜，灭活 30 间轻轻地不停摇晃，使其受热均匀； （ 4） 30 ，将血清瓶置于超净工作台中，分装于 10 小瓶当中， 储存备用。 冲液的配制（ （ 1） 电子称预热 30 （ 2） 准确称量 .0 g； 0.2 g； 0.2 g； g （ 3） 按上述称量顺序依次将其溶解于 750 蒸水中并不断搅拌，使其充分溶解； （ 4） 用容量瓶定容至 1000 分装于 250 瓶子当中，高压灭菌，插 12号针头排气； (5) 高压灭菌后， 放至室温后，置于 4 冰箱储存备用。 的配制 （ 1） 电子称预热 30 （ 2） 准确称量 8.0 g； 0.4 g； 2g； g； g； 酚红 g; (3) 将以上物品溶于 750 蒸水当中，不断搅拌，使其充分溶解； （ 4） 用容量瓶定容至 1000 装于 250 中，高压灭菌，插 12 号针头排气； （ 5） 高压灭菌后，放至室温后，置于 4 冰箱储存备用。 蛋白酶的配制 （ 1） 电子称预热 30 （ 2） 准确称取酶粉 g，加入干燥烧杯中，加少许 其充分溶解； 用容量瓶定容至 100 于 4 冰箱过夜； （ 3） 超净工作台紫外照射 30 ，将胰酶置于超净工作台中，用高压灭菌的蔡氏滤器过滤除菌； （ 4） 分装于 10 小瓶中， 储存备用。 罗格列酮的配制 将 10 格列酮粉剂溶解于 28 l 中， 4 冰箱储存备用。使用前用细 胞培养基稀释至终浓度为 5 、 10 、 20 的工作液。 细胞冻存液的配制 7 牛血清 2 甲基亚砜 （ 1 10 4 储存备用。 胞复苏、培养及冻存 胞复苏 （ 1） 超净工作台紫外线消毒 30 ，先配置 10 胞复苏后第一次所用的复苏液（其中含 20%的胎牛血清， 1%的双抗 ）； （ 2）从液氮罐中取出细胞冻存管（容积 1.5 放入提前准备好的 37 水浴中解冻（注意水不要接触到封口胶布）约 1-2 （ 3）进入细胞培养室，用 75%酒精棉球擦拭冻存管外周后转入超净工作台中，旋开管盖，用无菌玻璃吸管吸出细胞悬液，移入已加好无血清的培养基的无菌离心管当中，低速（ 800 离心 5 （ 4）弃上清，向离心管当中加入完全培养基（含 10%胎牛血清的 养基）将细胞混匀后移入无菌培养瓶中，再加入适量的刚配好的完全培养基，置于 37 、 5%养箱中培养， 隔日更换培养液。 胞的培养、传代 （ 1） 胞用完全培养基在 37 、 5%养箱中静置培养，每2更换一次培养液； （ 2）当细胞生长到一定密度时（大约 70% ,将旧的培养基倒掉，吸取3-4 冲液 冲洗 2； （ 3）用 1 加样枪吸取 1 酶消化（大约 5 右）； （ 4）加入 3-4 全培养基终止胰酶的消化；轻轻吹打细胞数次，将贴在瓶壁上的细胞吹打下来； （ 5）用无菌玻璃吸管吸完培养瓶中的细胞悬液，移入 10 菌离心管中；1000 心 5 （ 6）弃去上清液，用加样枪加 1 全培养基，将细胞吹匀后，吸取适量细胞悬液加入无菌培养瓶中，加入适量完全培养基，保持密度为 2106 个 / （ 7）待细胞进入对数生长期后，用于实验。 胞冻存 （ 1） 将旧的培养基倒掉 ； (2)用 冲液 冲洗 2 ,用加样枪吸取 1 酶消化细胞 (大约 5 ,消化好之后 ,加入 3-4 全培养基终止胰酶消化 ； (3)用无菌玻璃吸管轻轻吹打细胞数次 ,将贴在细胞壁上的细胞吹打下来 ; (4)将全部细胞悬液移入 10 无菌离心管中 , 1000 心 5 (5)离心后弃去上清液 ,将先前配好的细胞冻存液 (1 入离心管中 ,将细胞吹匀 ,吸出后全部加入冻存管中 ； (6)先置于 4 冰箱 2 h,再置于 冰箱 2 h,最后 过夜 ,次日置于液氮罐中长期保存。 胞种板、加药及实验分组 调节 胞浓度为 2106 个 /细胞接种于 96 孔板中，实验分为 5 组，巨噬细胞组（空白对照组），泡沫细胞组（模型组）、罗格列酮组（ 5 ） 、罗格列酮组（ 10 ） 、罗格列酮组（ 20 ），放入细胞培养箱（ 37 ， 5% 培养。巨噬细胞组：加入 全培养基孵育 48 h；泡沫细胞组：加入终浓度为 30 的 育 48 h； 罗格列酮组（ 5 ） ：加入终浓度为 30 的 孵 2 h，再加入终浓度为 5 的罗格列酮共同刺激 48 h 后观察结果；罗格列酮组（ 10 ） ：加入终浓度为 30 的 孵 2 h，再加入终浓度为 10 的罗格列酮共同刺激 48 h 后观察结果；罗格列酮组（ 20 ） ：加入终浓度为 30 的 孵 2 h，再加入终浓度为 20 的罗格列酮共同刺激 48 h 后观察结果；细胞培养终止后，用油红 O 染色鉴定泡沫细胞模型，用胆固醇氧化酶法检测细胞胆固醇含量，用 术检测细胞 表达。 红 O 染色鉴定泡沫细胞模型 (1)染色液的配制 材料 :油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、漏斗、定性滤纸 方法：称取油红干粉 0.5 g， 溶于少量异丙醇当中，然 后加异丙醇至 100 色瓶密封 4 保存为储备液，可长期保存。用时取 6 双蒸水 4 性滤纸过滤，稀释后 2 h 内用完。 （ 2） 染色步骤： 1） 细胞培养终止后，小心轻缓地倒去培养液； 2） 用 冲液 轻缓漂洗 2； 3）加 4%的多聚甲醛固定 30 用 冲液 轻缓漂洗 2； 4）稀释油红储备液，油红 :去离子水 =3:2，定性滤纸过滤；室温放置 10 5）加入油红染色液， 37 染色 30 色液加的量以覆盖板底为宜； 6）将油红染色液轻缓倒掉，用 冲 液 轻缓漂洗 2； 7）显微镜下观察拍照。 胆固醇氧化酶法检测细胞 总胆固醇含量和游离胆固醇含量 （ 1）细胞裂解： 1)细胞培养终止后 ,用 冲液 轻缓漂洗细胞 2 ,取出残存培养基 ,以免影响 胞内胆固醇含量的测定； 2)消化、离心收集细胞或者直接在培养板内裂解细胞； 3)按比例每 1106 个细胞加入 0.1 细胞裂解液，混匀裂解，用移液器反复吹打细胞， 使细胞充分裂解 。 (2）细胞裂解液的处理： 1)取 500 l 的细胞裂解液，转移到 1.5 离心管当中，进行下 一步的操作 ； 2)室温 2000 心 5 收集 上清液用于酶学测定。 （ 3）工作液的配制： 作液按 4:1 比例配置，取 4 剂 1 剂 匀后即可，立即使用。 （ 4）标准品的稀释： 5 M（ 5000 ） 的胆固醇标准品用无水乙醇稀释为 2500 、1250 、 625 、 、 156 、 78 、 39 ；设置不含胆固醇的乙醇为零浓度的空白对照管。 （ 5）测定细胞内胆固醇的含量： 1)加入 10 l 的标准品、乙醇（空白对照组）及 待测样品，样品体积不可超过 20 l ； 2)取 190 l 工作液加入 96 孔板中（每个孔都需要加入混合好的工作液）； 3)37 孵育 20 测定（延长反应时间可能使游离胆固醇酯增加而使其值与总胆固醇值接近）； 4)将 96 孔板置于酶标仪中，调节波长 570 始测定各孔 。 用 术检测细胞表面 表达 剂的配制 (1)母液的配制： 1) 1.0 50 积 g 蒸馏水 200 解后，用浓盐酸调 所需点（如下所示），最后用蒸馏水定容至 250 温灭菌后室温下保存。 约 17 约 16 约 15 约 10 ) mg/10 ) g 异丙醇 100 解后，分装于 1.5 离心管当中， 保存 。 3) 0.2 12 g 蒸馏水至 500 解后，高压灭菌，室温保存。 4） 0.2 2W 71.6 g 蒸馏水至 1000 解后，高压灭菌，室温保存。 5） 10% 10 g 蒸馏水至 100 0 水浴下溶解，室温保存。 6) 10 %过硫酸铵 （ 过硫酸铵 10 g 超纯水 1.0 解后， 4 保存，保存时间为 1 周。 7) 1.5 ( g 超纯水 200 解后，用浓盐酸调整 最后用超纯水定容至 250 高压灭菌后室温想下保存。 8) 0.5 ( g 超纯水 200 解后，用浓盐酸调整 最后用超纯水定容至 250 高压灭菌后室温想下保存。 9) 10137 2.7 10 2 8 g 10 0.2 g10 g10 g10 溶于 800 纯水中，用浓盐酸调整至 用超纯水定容至 1 L,高压灭菌后保存。 10) 20 % 20 馏水至 100 匀后 4 保存。 (2)使用液 1) 30 %丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺 （ 29 g 甲叉双丙烯酰胺 （ 1 g 去离子水至 100 于棕色瓶中于室温储存。 2) 10 %过硫酸铵（ 保存） 过硫酸铵 1 g 去离子水至 100 解后，置于室温保存。 3) ( 8 g 0.2 g g g 溶于 800 馏水中，用浓盐酸调整 蒸馏水定容至 1 升，高压灭菌后室温保存。 4) 18.2 g 滴加 去离子水，定容至 100 次调整 ) g 滴加 去离子水，定容至 100 再次调整 ) 10蛋白电泳缓冲液 30 g 甘氨酸 144 g（ 10 g 去离子水至 1000 ) 2白上样缓冲液 5 0% 4 2 1000 0%甘油 4 %溴酚蓝 （ 4 ) 考马斯亮蓝 溶液 马斯亮蓝 0.5 g 甲醇 125 酸 35 离子水 定容至 500 滤，滤去不容沉淀，棕色瓶室温保存。 9) 蛋白转移缓冲液 甘氨酸 g g 20%甲醇 100 离子水 定容至 500 0) 封闭液（含 5 %脱脂奶粉的 冲液） 脱脂奶粉 5 g 100 解后 4 保存，使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。 11) 分离胶和浓缩胶的配制 10%分离胶 （ 10 8%分离胶 （ 10 5%浓缩胶 （ 5 蒸馏水 4 4.6 3.4 30% ) 3.3 2.7 2.5 2.5 0% 100 l 100 l 50 l 10% 硫酸铵 ) 100 l 100 l 50 l 4 l 6 l 5 l 12) 冲液 1 10 8.8 g 蒸馏水至 1000 3) 冲液（含 冲液） 20% 700 匀后即可使用，最好现用现配。 作步骤 （ 1）蛋白样品的制备 细胞蛋白提取过程如下 1）将准备完毕的各组细胞弃去培养液； 2） 4 预冷的 冲液洗涤细胞三次，将 冲液 弃净后细胞培养板置于冰上； 3） 从 冰箱中取出 胞裂解液，室温溶解后， 1 胞裂解液加入 10 0 l 混匀，使 浓度为 1 ； 4） 每孔加入 150 l 的 胞裂解液，于冰上裂解细胞 30 5） 细胞裂解完全后，用细胞刮刀将细胞刮下，收集细胞碎片和裂解液移至1.5 P 管中； 6） 4 ,12000 心 5 收集上清液。 （ 2） 测定蛋白浓度： 1） 将标准蛋白 （ 30 加到 1.2 白标准配制液中，充 分溶解后配制成 25 mg/蛋白标准母液，分装成数管于 保存； 2） 取适量 25 mg/蛋白标准母液，用 解液稀释至终浓度为 0.5 mg/蛋白标准品； 3） 将 0.5 mg/蛋白标准品按 0,1,2,4,8,16,20 l 加到 96 孔板的标准品空中，加入 解液补足到 20 l ； 4） 加 5 l 样 品到 96 孔板的样品孔中，加 解液补足到 20 l ； 5） 根据样品数量，按 50 体积 剂 A 加 1 体积 剂 B（ 50:1） 配制适量 作液， 作液室温 24 h 内稳定； 6） 各孔加入 200 l 作液， 37 放置 20 7） 将 96 孔板置于酶标仪上，选取 562 长测定结果。 （ 3）实验流程： 1)安装电泳槽：将玻璃板洗干净后用无水乙醇润洗两面，晾干，将薄玻板和厚玻板小心夹好，嵌入相应的玻璃板槽内，玻板底部绝对对齐，形成玻璃板夹心制胶膜准备灌胶； 2)制胶：根据目的蛋白的大小选择 10%（ 及 8%（ 分离胶，在分离胶中加入 温混匀后立即倒入垂直玻璃板之间，约 30 固后，倒去蒸馏水，用滤纸吸干。分离胶配好后，配置 5 %的浓缩胶，室温混匀，倒入分离胶上 ，迅速插入点样梳，当见到水和胶面之间有明显折线时，说明胶已经凝固好，倒去上层水，小心拔出点样梳，水洗后用滤纸吸干。 3)上样：将样品加入 1 倍体积的 2样缓冲液，沸水浴 5 胶放入电泳槽中，加入约 350 电泳缓冲液，将已经处理好的样品上样，用 10 l 的小移液枪向各点样孔中加样，蛋白最大体积为 24 l ，每孔加2，在样品一端加 5 l 的 4)电泳：先稳压 80 V 30 调 110 V 60 右。 5)转膜（湿转）： 用浅盘盛转膜缓冲液浸泡海绵、滤纸，根据片段大小切胶； 剪 ，膜的宽度 1.0 长度和胶的长度一致并做如下处理 a: 浸于 100%甲醛溶液当中 10 s b: 浸于去离子水中 3 c: 浸于转膜缓冲液当中 3 匣子里的黑面泡在电泳漕里，水不能太多或者是太少，以滤纸刚好不能飘起为宜，三明治法贴膜： 海绵垫 2 层滤纸 胶 2 层滤纸 海绵垫 轻柔操作，小心气泡，贴膜一定要将条带位置完全覆盖，盖滤纸时小心膜的移位； 转膜漕接上电源后放在冰上转膜，几乎将整个转膜盒全部埋入，不要将整个盖子埋进去； 调整电流： 25 17 h 200 150 200 150 200 120 转膜后，将膜拿出来， 转膜冲洗干净， 15 三次；用在塑料皿中待用。 6)封闭、一 抗、二抗： 转膜完毕后，将膜拿出来放入干净的塑料培养皿中； 向培养皿中倒入配置好的封闭液约 20 温摇床上摇 2 h； 膜封闭完毕后，用 2， 10次，洗干净即可； 弃去 培养皿中加入 10 抗工作液，将培养皿放置 4 摇床上过夜； 一抗工作液： 0.5 g 2%叠 氮纳 100 l 一抗原液 5 l 10 涤 3 次，弃去 培养皿中加入 15 抗工作液，将培养皿放置摇床上室温摇 2-3 h； 二抗工作液：二抗原液 3l 15l 倾去二抗， 涤 3 次，用 着膜， 4 保存， 12 h 内曝光。 7) 色 将保鲜膜或 套剪成合适大小待用 ,大概 1015 用小弯剪小心夹膜的 遍，用滤纸小心蘸干膜的背面（小心不要损失正面的蛋白），稍稍蘸干 ,放在小玻璃皿中； 膜，避光操作，原则是 27 下大小的膜，需要 液 （ 1 液 （ B 液） 1 冲洗膜大约 10 次左右 ,黑暗中看看是否有光； 用滤纸将膜稍稍蘸干 ,用保鲜膜或 将之包好， 放入夹片中曝光 ； 底片置于显影液 中 1 来水冲洗干净，定影液中 30 s； 自来水冲洗干净 ,晾干 ,灯光下观察结果； 各组均以 白作为内参照 ,用 图像分析软件 分析结果， 计软件 进行统计学处理 。 采用 计学软件进行统计学分析， 计 量资料以均数标准差（ x s ） 表示，组间比较采用单因素方差分析 ( P 第三章 结 果 的建立 噬细胞与终浓度为 30 的 同孵育 48 h 后，采用油红 O 染色，显微镜下观察，细胞体积增大，胞浆疏松化，细胞浆内有大量红色脂滴存在，符合泡沫细胞的形态学特点（图 1）， 采用胆固醇氧化酶法检测细胞总、游离胆固醇含量，胆固醇酯含量由两者差值得到， 细胞内胆固醇酯 /总胆固醇 50%，造模成功（表 1） 25。 图 1、泡沫细胞油红 O 染色（ 目镜 40） 固醇含量的测定 细胞培养终止后，采用胆固醇氧化 酶法检测泡沫细胞总胆固醇含量、游离胆固醇含量， 胆固醇酯含量 由两者差值得到。结果显示，模型 组细胞 胆固醇 /总胆固醇 50%，符合泡沫细胞的标准。 与空白对照组相比 ,泡沫细胞组总胆固醇含量增加 ( 与 )，差异具有统计学意义 (P 游离胆固醇含量增加 ( 与 )，差异具有统计学意义 (P 胆固醇酯含量增加 ( 与 )，差异具有统计学意义 ( P 与泡沫细胞组相比，罗格列酮组（ 5 ） 总胆固醇含量下降（ 与 ），差异具有统计学意义（ P 游离胆固醇含量下降（ 与 ），差异具有统计学意义（ P 胆固醇酯含量下降（ 与 ），差异具有统计学意义