【毕业学位论文】（Word原稿）藏红花素对白血病K562细胞抑制作用的初步研究

兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 1 前言 白血病（ 一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，因白血病细胞具有自我更新、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等特点，因此，细胞多停滞在发育的原始、幼稚阶段。白血病细胞在骨髓和其他造血组织中多会大量增生累积，导致正常造血受抑制并浸润其他器官和组织。白血病患者病情复杂，治疗难度极大，预后差，严重的威胁着人类健康和生命安全。据统计，我国白血病发病率约为 0 万。在恶性肿瘤所导致的死亡率中，白血病位居第六位（男）和第八位（女）；儿童及 35岁以下成人中，则居第一位 1。 目前 白血病治疗方法主要有 ： 化学治疗 、 放射性治疗 、造血干细胞移植 （ 、免疫治疗 等 。而临床应用较多的是大剂量抗肿瘤药物和骨髓集落刺激因子联合的化学治疗方法、造血干细胞移植技术 2。这使得白血病的缓解率（ 大大升高，也提高了白血病患者的生活质量、延长了患者的总生存时间 （ 。但是这些治疗方法也存在较大的局限性，主要有：发病时机体功能差者不能耐受化学治疗。且由于目前化疗药物大多为非选择性的，患者经过长期连续的化 疗之后， 白血病患者的机体免疫功能受到进一步的损害 ，再不能续接受化疗 3；白血病患者在受连续、强化的化疗后由化疗药物所导致的严重不良反应；造血干细胞移植后有可能引发第二肿瘤的出现 4；经上述的治疗后白血病复发；白血病细胞多药耐药（ 出现导致治疗不能继续 5；造血干细胞移植的异基因的供体来源不足；老年患者不能耐受造血干细胞移植前的标准清髓化疗方案所带来的毒副作用 6。已有治疗方法存在的局限性，严重影响着白血病患者的 S 及无病生存率（ 7。因此，寻求高效低毒的新型抗白血病药物、减轻化疗药物毒副作用、提高白血病患者的生存质量、减少白血病的复发已经成为目前治疗白血病研究亟待解决的问题。 细胞凋亡 (称细胞程序性死亡 (是为维持 机体 内环境稳定，由多 基因 严格控制的细胞自主有序的死亡过程 8。 细胞凋亡是通过多基因位点启动的，在细胞周期任何时相都可以发生，但就某一种类型的细胞而言，基因可能编码于某个特定时相来启动细胞凋亡，因此，不同来源的细胞会有不同时相的启动点 9。研 究表明白血病细胞的凋亡也有其内部通路，只是这个通路被抑制，导致白血病细胞寿命延长，破坏了生长与死亡之间的动态平衡 10。因而， 自 1993 年 1提出通过诱导细胞凋亡来治疗白血病的方法后 ， 不仅化疗药物诱导白血病细胞凋亡的研究层出不群，而且通过中药及其有效成分诱导白血病细胞凋亡的研究也逐渐增多。 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 中 医 药作为我国的传 统治疗方法，其具有 以下优点：广泛的来源 、价格 相对 低廉、毒副作用小等 。研究者的大量工作已经证实，中医药及其有效成分具有抑制白血病细胞增殖的细胞毒作用 12、诱导 白血病 细胞凋亡 13、促进 原始及 幼稚 的白血病细胞 进一步 分化 14、逆转 多药 耐药细胞的出现 的作用 15，还可以提高白血病患者的机体免疫力，进而减轻化疗对机体的损害 16。目前中医药治疗白血病 研究最成熟的是三氧化二砷，三氧化二砷俗称砒霜， 在中医药中有“毒物之王”之称。在古代多用于治疗昏睡病、肺结核、皮肤病及部分肿瘤，但因毒性过大，限制了其广泛的应用 17。研究证实三氧化二砷 具有选择性细胞毒作用，通过影响各种抑癌基因和原癌基因的表达，干扰 合成 与 克隆、增殖能力，抑制白血病细胞端粒酶的活性，从而抑制白血病细胞增殖，尤其在治疗急性早幼粒细胞白血病（ 面 18。 近年来，有关冬凌草甲素治疗白血病的研究也逐渐增多，冬凌草甲素能够明显的抑制 白血病 细胞的增殖。其中对冬凌草甲素体内外靶向作用于 t(8； 21)的 合蛋白的研究已取得重大突破，该项研究证明冬凌草甲素抑制 t(8； 21)白血病细胞生长并诱导细胞凋亡，其可能通过靶向定位于 基 蛋白而实现抗白血病 19。 中医药及其有效成分诱导细胞凋亡相关机制有以下几点： 膜受体通路实现凋亡 ： 膜受体通路是由胞外肿瘤坏死因子 (家族的死亡配体结合细胞表面的死亡受体 (如 发，经过一系列反应进而启动 级联反应，实现凋亡 20。体外研究证明冬凌草甲素通过膜受体 路调控细胞色素 C 释放，启动线粒体途径诱导 胞 （ 组织细胞淋巴瘤细胞 ） 凋亡 21。唐宇宏等 22用葛根总黄酮 (of 理 胞（ 急性早幼粒细胞白血病细胞株 ） ，在一定浓度范围内 胞的早期凋亡率增高，其促凋亡的机制可能是通过 氨基末端残基发生磷酸化 ） 活化后增强 表达，引起一系列促凋亡因子 的释放，进而实现凋亡。 线粒体途径促进细胞凋亡 ： 线粒体是细胞凋亡的调控中心。线粒体可以释放细胞色素 C，还可以释放 促凋亡因子。 促凋亡因子 反过来 能诱导细胞色素 C 的 释放和凋亡小体的形成 23。研究表明，部分中医药可以调节细胞色素 C 从线粒体释放。冬凌草甲素可以使 t(8； 21)染色体易位的白血病细胞的线粒体膜电位崩解，下调 放细胞色素 C，形成凋亡小体，进而活化 导致其底物降解来诱导凋亡 15。另外 ， 姚根宏等 24的研究表明薏苡仁油通过影响线粒体膜电位诱导 胞 （ 急性 T 细胞白 血病细胞 ） 凋亡。还有研究证实雷公藤甲素 也 通过线粒体途径诱导白血病细胞凋亡 25。 通过 化最终实现 细胞 凋亡 ： 细胞凋亡的过程实际上是 可 逆转的 级联放大反应过程 26。目前 很多研究均已证实，中医药及其有效成分实现 诱导 白血病 细胞凋亡 的机制与其可以诱导 化 并 促进 级联反应密切相关。 凋亡的基因兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 调控：大量的研究资料显示，细胞凋亡的启动和传导需要多种基因及其产物的参与。研究最清楚的 3 个细胞凋亡的调节基因是， 因 27： 肿瘤中最易发生突变的抑癌 基因，而 白的主要功能是能将细胞阻滞在 和诱导细胞凋亡； 因 28： 过过度表达可抑制正常细胞及肿瘤细胞凋亡； 因：码的蛋白为 合的转录因子，一方面能促进细胞增殖及恶性转化，又能参与细胞凋亡 29。 藏红花（ 名西红花，属科番红花属球根类草本植物。是我国传统的中医药，调查发现，在民间中药组方中，藏红花曾被用于治疗慢性粒细胞白血病。主要分布于南欧各国、伊朗等地，我国主要分布在西藏，在北京、浙江及上海也有种植。藏红花 主要来源于花的柱头，因其产量极低，采收又耗时费力，素有“植物黄金”之称，在我国已经被列为珍稀名贵的中药材。本草纲目记载，藏红花性味甘平、入心肝经、解郁开节，具有有活血、润燥、止痛、散肿和通经的功效 30。曾有学者报道，藏红花还具有防腐蚀、抗氧化、抑制血栓形成、减轻缺血再灌注对记忆损伤的作用。传统医学中多用于治疗跌打损伤、伤寒、咳血等疾病。近年来，有关藏红花有效成分及其抗肿瘤机制的研究也逐渐增多。已经发现的藏红花有效成分有：藏红花素（ 藏红花苦素（ 藏红花醛（ 藏红花酸（ ，它们均具有明显的抗肿瘤作用，特别是对白血病、结肠癌、卵巢癌、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤都具有强的抑制作用，而且几乎无毒副作用 31。藏红花抗肿瘤的可能机制是：藏红花对细胞的 成有明显抑制作用，但对蛋白质合成无影响 32。藏红花的细胞毒性作用与类胡萝卜素和拓扑异构酶（交连异构酶，是有关 互联系有关，拓扑异构酶可参与细胞 33。最近研究表明，由类胡萝卜素转化为类维生素 A 这种代谢物的转化 机理，并不是藏红花抗肿瘤活性的必备条件 34。藏红花的抗氧化作用与其对细胞自由基链反应的抑制作用有关，因为多数类胡萝卜素是脂溶性的，可以作为膜联合的高效的自由基清道夫 35。因此，藏红花成了新型抗肿瘤药物的研究热点。 另外，藏红花及其有效成分还具有以下几点作用：提高机体免疫力，其对体液免疫及细胞免疫均有增强作用 36。临床上藏红花可治疗人体多种慢性疾病，可增强淋巴细胞的增殖反应，以此来提高机体的细胞与体液免疫；从藏红花中提取的蛋白多糖能促进巨噬细胞的活性，具有免疫调节、抗侵入的作用 37；藏 红花还具有抗氧化活性，藏红花可通过增加细胞内还原型谷胱甘肽及谷胱甘肽相关酶类的水平，进而实现抗氧化活性 38。其中藏红花素是通过有效抑制氧自由基及黄嘌呤氧化酶的活性，进而实现抗氧化生物活性 39。这些作用为藏红花进一步应用于肿瘤治疗奠定了基础。 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 藏红花素其分子式 子量为 977 21黄色粉末，具有水溶性，藏红花素还具有高抑制性，因此，研究者认为藏红花素的抗肿瘤机制可能与其对肿瘤细胞的强烈细胞毒作用有关。通过体外实验已经证实，藏红花素表现出明显细胞毒效应，其作用的肿瘤细胞出现了广 泛的胞质空泡样变性区域及胞浆少，但对细胞核无明显影响；同时还发现藏红花素作用于不同细胞株时其敏感性也不同，即对不同细胞株的半数致死量不同 31。最近研究证实其抗肿瘤机理可能是：破坏了细胞的成酶系，即破坏了 成至关重要的 蛋白质联系的媒介如拓扑异构酶，从而抑制 合成，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。此外，藏红花素还抑制细胞蛋白激酶的活性以及原癌基因的表达。赵培 40等通过体外实验证实：藏红花素可抑制 胞（膀胱移行细胞癌细胞）裸鼠移植瘤的生长，其作用的分子机制与以下四个 基因相关：藏红花素通过上调 因、下调 因即使 因的比例上调，继而诱导移植瘤细胞凋亡； 因可以抑制 胞的凋亡，藏红花素可抑制 因的表达，使其丧失对凋亡的抑制，实现了肿瘤细胞的自发凋亡，并增强了对细胞周期的负向调节，抑制了细胞分裂；藏红花素通过抑制 1 基因的表达，导致细胞周期停滞，从而抑制肿瘤细胞增殖。本实验通过观察不同浓度藏红花素对白血病 胞增殖能力的影响，初步探讨藏红花素抗白血病作用的机制。 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 材料与方法 1 实验主要材料及仪器 验细胞 胞购于上海博谷生物科技公司。将 胞培养于含有 10%胎牛血清的 养 基 中，在 37 、 5 和湿度的培养箱中培养 ，实验前保证细胞活性 98%，实验中细胞均处于对数生长期。 验主要试剂 试剂 来源 藏红花素 美国 司 二甲基亚砜 上海博谷生物科技公司 甲基噻唑基四唑 (上海博谷生物科技公司 碘化丙啶 (上海博谷生物科技公司 国 司 上海博谷生物科技公司 胎牛血清 (杭州四季青公司 1 3 实验主要仪器 仪器 厂家 超净工作台 上海新苗医疗器械制造仪器厂 低温冰箱 中国生命科技股份有限公司 二氧化碳细胞培养箱 日本 温超速离心机 美国 司 低速离心机 北京医用离心机厂 数显恒温水浴锅 郑州杜甫仪器厂 置光学显微镜 日本 动台式灭菌器 山东新华医疗器械有限公司 式细胞仪 司 微量可调移液器 德国 司 96 孔培养板、吸管、离心管等 北京赛多利斯天平有限公司 紫外分光光度仪 美国 司 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 2 主要实验方法 红花素 试剂配制 在 无菌条件下将 1000红花素 溶于 20、 ，并加 藏红花素 的稳定剂）配成 50mg/50） 的 储存液 ，后4 贮存。 待使用 时 用 、 释为适当浓度。 验分组 取常规 培养处于对数生长期的 胞， 实验分为 组， 藏红花素 终浓度分别为 0、 0 625、 2 5、 10 mg/阳性对照组（硼替佐米 400ng/检测药物作用时间分别为 12h、 24h、 36h、 48h。 562 细胞的培养 取常规培养处于对数生长期的细胞，细胞接种于 96 孔细胞培养板中，每孔 100于 5% 37、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞接种 6h 后，用倒置光学显微镜观察细胞生长情况，分别将 100l 含 10%胎牛血清的培养液配制的不同浓度的藏红花素加入细胞培养板的每个孔 中，每个浓度组设 6 个复孔，并设硼替佐米为正常对照组，继续培养。培养过程中，分别于加药前及加药后 12h、 24h、 36h、48h 用光学倒置显微镜观察细胞的生长状况，并拍照记录。 562 细胞生长曲线的测定 取常规培养的各个浓度组的 胞。于加药后 12、 24、 36 和 48h 时将每组各孔取细胞计数，采用血细胞计数板人工计数法，取每组平均值绘制生长曲线。 1. 测细胞增殖活性 1) 收集对数期细胞，调节细胞悬液 浓度 1 106/按下列顺序依次加入： 血清 ） 培养 液 40l ； 加 10l 用 培养液 稀释 至 1g/预试寻找最佳 稀释度 ，1:100)； 加入藏红花素花素 10l； 细胞悬液 50l（即 5 104 细胞 /孔），共 100l 加入到 96 孔板（边缘孔用 无菌 水填充）。 每板设对照（加 100l 储存液）。 2) 置 37 ， 5%育 ，于 孵育 12、 24h、 36h、 48h 后在 倒置 光学 显微镜 下观察。 3) 分别 每孔加入 10 l 液（ 5 mg/ 继续培养 4 h。 4) 离心 （ 1000 转 10小 心吸掉上清，每孔加入 100 l 二甲基亚砜 （ ，兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 置 摇床 上低速 振荡 10 结晶物充分溶解。在酶联 免疫检测仪 630准）测量各孔的吸光值。 5) 同时设置调零孔（培养 液 、 对照孔（细胞、相同浓度的 药物溶解介质、培养液、 每组设定 3 复孔 6) 计算细胞生长抑制率（ 计算公式如下： 1-（ （ 100%， 空白组吸光值， 正常对照组吸光组， 各不同剂量给药组吸光值。 2. 流式细胞检测仪检测 胞凋亡率 1) 离心收集藏红花素各浓度处理 24h、 36h、 48h 后的 浮细胞，微量离心机转速 2000心时间 5培养液。 2) 用冷 涤细胞两次（ 2000心时间 5集细胞）。 3) 在悬浮细胞中加入 400l 结合缓冲液，细胞浓度调整至 1 105 细胞 / 4) 在细胞悬浮液中加入 5l ，轻轻混匀后于 2C 避光条件下孵育 15 分钟。 5) 加入 10l 轻轻混匀于 2C 避光条件下孵育 5 分钟。 6) 在 1 小时内用流式细胞仪进行定量检测，细胞应分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。 在双 变量 流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（ 右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（ ；而右下象限为凋亡细胞，显现（ 3 统计学分析方法 应用 0 统计软件进行统计，结果以平均值标准差（ s）表示。采用方差分析整体差异性；应用 t 检验分析实验组、对照组之间的差异；以 P 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 结果 1. 藏红花素作用下 经过计数各组 红花素分别作用于2h、 24h、 36h、 48个时间组内不同浓度间的方 差分析，差异有显著性 (一组内各浓度间比较差异有显著性 (P 表 1） 。随着藏红花素浓度的升高， 现出明显的抑制作用，以 浓度组抑制作用均弱于硼替佐米对照组）。当藏红花素的浓度为在 0同作用时间下，随药物浓度的升高，白血病 线性负相关（图 1）。当藏红花素浓度增至 着作用时间的延长，细胞数目也明显减少，将 482异有显著性 (t=P 表 1，图 2） 图 1 相同作用时间后不同浓度的藏红花素处理的 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 表 1 不同浓度的 藏红花素 在不同作用时间下的 105， s） 不同时间 不同药物浓度（ mg/ 0） 10） 硼替佐米组 12h 24h 36h 48h 在作用时间相同时，各组间比较 P 藏红花素浓度为 10mg/用 482 4h 36h 28105）0246810121416182022空 白组0. 625m g/ m 5m g/ m g/ m 图 2 不同浓度的 藏红花素 在不同作用时间下的 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 2. 562细胞生长抑制率的比较 一作用时间时，随着药物浓度的增加， 间比较差异有显著性 (P 10mg/藏红花素浓度增至 10mg/着作用时间的延长， 482异有显著性 (t=P (表 2) 表 2 各组 %， s） 藏红花素 不同作用时间 mg/2h 24h 36h 48h 0 10 硼替佐米 在作用时间相同时，各组间比较 P 藏红花素浓度为 10mg/用 482 3 各组 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 3. 藏红花素诱导 通过流式细胞仪测定细胞凋亡率时发现，藏红花素作用 24h 时，各不同浓度组间比较差异有显著性 (F=331， P 度时，随着藏红花素浓度的增加细胞凋亡率呈升高趋势，各组与空白对照组相比，差异均有显著性 ( 细胞凋亡率最高，与实验各组相比差异有显著性 (P 均 藏红花素浓度为 10mg/，细胞凋亡率反而下降，与 比，差异有统计学意义 (P 红花素作用 36h、 48h 时，与作用 24h 结果类似。在藏红花素浓度为在 ，作用 36h、 48h 时与 24h 时相比有统计学差异 (P 均 红花素浓度为 10mg/，作用 36h、 48h 与 24h 时相比差异无显著性 (P 均 图 4，表 3)。 红花素浓度 : 红花素浓度 :2.5 mg/ 兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 红花素浓度 :10 mg/ 图 4 藏红花素作用 48562细胞凋亡结果 表 3 藏红花素作用不同时间细胞凋亡率（ %， s） 组别 藏红花素 细胞凋亡率 （ mg/ 24h 36h 48h 0 10 组与 A 组相比， P 均 C 组与 D 组比较 P . 藏红花素对 流式细胞仪检测细胞周期结果显示：藏红花素作用于 81期细胞数比例组间差异有显著性（ F=200， P P 着藏红花素浓度升高， 1期细胞数比例升高，以浓度为 0/实验各组比较差异有兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 显著性 (O 01。当藏红花素浓度升高至 10mg/1期细胞数比例反而下降，与浓度为 P 与其余各组比较差异无统计学意义 (表 4)。 表 4 藏红花素作用后 0/%， s） 组别 藏红花素（ mg/ 1期细胞数比 例 0 组 组 与各组间比较 P 与 C 组比较 P 州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 讨论 白血病患者病情复杂，治疗难度极大，预后差，严重的威胁着人类健康和生命安全。目前 白血病治疗方法主要有 ：化学治疗 、 放射性治疗 、造血干细胞移植、 免疫治疗 等 。但是这些治疗方法也存在较大的局限性，这严重影响着白血病患者的 此，寻求高效低毒的新型抗白血病药物、减轻化疗药物毒副作用、提高白血病患者的生存质量、减少白血病的复发已经成为目前治疗白血病亟待解决的问题。 随着各项研究技术的进步， 近年来 有关 中医药治疗白血病的研究 也 逐渐增多。研究者的大量工作已经证实，中医药及其有效成分具有抑制白血病细胞增殖的细胞毒作用 、诱导 肿瘤 细胞凋亡、促进 原始及 幼稚 的白血病 细胞分化、逆转 多药 耐药细胞的出现 的作用，还可以提高白血病患者的机体免疫力，进而减轻化疗对机体的损害。研 究表明白血病细胞的凋亡也有其内部通路，只是这个通路被抑制，导致白血病细胞寿命延 长，破坏了生长与死亡之间的动态平衡。因而， 自 1993 年 出通过诱导细胞凋亡来治疗白血病的方法后 ， 不仅化疗药物诱导白血病细胞凋亡的研究层出不群，而且通过中药及其有效成分诱导白血病细胞凋亡的研究也逐渐增多。 中医药及其有效成分诱导细胞凋亡相关机制有以下几点： 膜受体通路实现凋亡 ： 膜受体通路是由胞外肿瘤坏死因子 (家族的死亡配体结合细胞表面的死亡受体 (如 发，经过一系列反应进而启动 级联反应，实现凋亡。体外研究证明冬凌草甲素通过膜受体 路调控细胞色素 C 释放，启动线粒体途径诱导 胞 （ 组织细胞淋巴瘤细胞 ） 凋亡。唐宇宏等用葛根总黄酮 (of 理 胞（ 急性早幼粒细胞白血病细胞株 ） ，在一定浓度范围内 胞的早期凋亡率增高，其促凋亡的机制可能是通过 氨基末端残基发生磷酸化 ） 活化后增强 表达，引起一系列促凋亡因子的释放，进而实现凋亡。 线粒体途径促进细胞凋亡 ： 线粒体是细胞凋亡的调控中心。线粒体可以释放细胞色素 C，还可以释放 促凋亡因子。 促凋亡因子反过来 能诱导细胞色 素 C 的 释放和凋亡小体的形成。研究表明，部分中医药可以调节细胞色素 C 从线粒体释放。冬凌草甲素可以使 t(8； 21)染色体易位的白血病细胞的线粒体膜电位崩解，下调 放细胞色素 C，形成凋亡小体，进而活化 15。另外 ， 姚根宏等的研究表明薏苡仁油通过影响线粒体膜电位诱导 胞 （ 急性 T 细胞白血病细胞 ） 凋亡。还有研究证实雷公藤甲素 也 通过线粒体途径诱导白血病细胞凋亡。 通过 化最终实现 细胞 凋亡 ： 细胞凋亡的过程实际上是 可 逆转的 级联放 大反应过程 。目前 很多研究均已证实，中医药及其有效成分实现 诱导 白血病 细胞凋亡 的机制与其可以诱导兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 化 并 促进 级联反应密切相关。 凋亡的基因调控：大量的研究资料显示，细胞凋亡的启动和传导需要多种基因及其产物的参与。研究最清楚的 3个细胞凋亡的调节基因是， 因： 肿瘤中最易发生突变的抑癌基因，而白的主要功能是能将细胞阻滞在 和诱导细胞凋亡； 因： 因： 码的蛋白为合的转录 因子，一方面能促进细胞增殖及恶性转化，又能参与细胞凋亡。 调查发现，在民间中药组方中，藏红花曾被用于治疗慢性粒细胞白血病。藏红花传统医学中多用于治疗跌打损伤、伤寒、咳血等疾病。近年来，有关藏红花有效成分及其抗肿瘤机制的研究也逐渐增多。藏红花约含 150 余种挥发性化合物和数种非挥发性化合物，现已鉴定出了 40 50 种组分。目前研究较多的具有抗肿瘤功效的主要是 (1)藏红花萃取物：主要是二甲基藏红花酸； (2)藏红花素：藏红花酸与二分子龙胆二糖结合而成的酯； (3)藏红花酸：属于类胡萝卜素类物质；其他具有抗癌作用的成分还 有，藏红花酸二甲酯 (藏红花苦素等。现代研究发现藏红花制剂具有明显的抑癌抗癌能力，对白血病、结肠癌、卵巢癌、乳头肉瘤、扁平细胞瘤和软组织肉瘤都具有很强的抑制作用，而且几乎无毒副作用。因此，藏红花成了新型抗肿瘤药物的研究热点。另外，藏红花具提高机体免疫力的作用，其对体液免疫、细胞免疫均有增强作用。再者，藏红花还具有抗氧化活性，藏红花可通过增加细胞内还原型谷胱甘肽及谷胱甘肽相关酶类的水平，进而实现抗氧化活性。其中藏红花素是通过有效抑制氧自由基及黄嘌呤氧化酶的活性， 实现抗氧化生物活性。这为藏红花进一步应用于肿瘤治疗奠定了基础。考虑到水溶性和高抑制性等因素，藏红花素被认为是藏红花成分中最有希望的抗癌药之一。 将藏红花萃取物 (200mg/重 )经口给予荷瘤小鼠，抑制小鼠来源肉瘤180(艾氏腹水癌 (道氏淋巴组织瘤腹水 (腹水瘤的生长，并显著延长经过治疗的荷瘤小鼠的生存寿命达 2。口服藏红花萃取物可强烈抑制小鼠 瘤细胞的生长，但对 瘤细胞的生长没作用 41。接受藏红花治疗的实验动物血清中 水 平的增加，有可能说明藏红花的抗肿瘤效应。将脂质体包裹的藏红花萃取物腹膜内注射入小鼠，可观察到此种萃取物对口服萃取物不敏感的几种实体细胞，包括 胞的抗肿瘤效应的增加。藏红花萃取物抗肿瘤活性的增强，是由于定点给药，或载体介导下药物溶解度的增加。用从藏红花中分离出的类胡萝卜素 延长其存活时间，并抑制肿瘤的生长，但对雄性动物则无任何显著效应。这些研究提示，藏红花素对雌性大鼠而不是雄性大鼠的选择性抗肿瘤作用，可能与激素因子有关42。 吴强等 43人初步探讨了藏红花浸出液 抑制肿瘤细胞增殖的机制，他们认为，藏兰州大学硕士研究生学位论文 藏红花素对白血病 胞抑制作用的初步研究 红花对 神经母细胞瘤）细胞的抑制作用可能与藏红花诱导 径可能参与了该凋亡过程。 44人的研究发现藏红花素和藏花酸酯均有抑制非洲淋巴细胞瘤病毒早期抗原表达的作用，而且前者的作用强于后者，并发现藏红花素及其衍生物二葡萄糖基藏红花酸和三葡萄糖基藏红花酸有抑制腺病毒感染早期肿瘤抗原表达的作用，并且有一定的剂量依赖性。 30人的研究表明，藏红花素能抑制 十四烷酰佛波醇 诱导的大鼠上皮肿瘤，这是由于藏红花素能减弱 激细胞蛋白的磷酸化水平，同时抑制 导的原癌基因的表达，从而抑制肿瘤形成。藏红花素对人膀胱移行细胞 胞同样具有抗增殖作用 45。 在体外试验中，藏红花素表现出了强有力的对肿瘤细胞的细胞毒效应，其作用的细胞表现出广泛的胞质空泡样区域和胞浆减少，但对细胞核的作用无明显改变，并发现藏红花素对不同细胞株的敏感性不同，即对不同细胞株半数致死量不同。研究者认为藏红花素的抗癌机制可能与其对肿瘤细胞的强烈细胞毒性有关。 42在藏红花素抗 鼠结肠腺癌的体内外实验的研究中发现，经藏红花素处理的雌性大鼠的生存期明显延长，从第七周开始肿瘤的直径明显减少；动物实验表明对于提前给予服用藏红花素的小鼠，藏红花素可以显著逆转致瘤小鼠病理学改变，引起肿瘤发生率和组织病理学的改变。大量研究均表明，藏红花素是一种潜在的抗肿瘤试剂 46。本实验观察了藏红花素对白血病 胞抑制增殖及诱导凋亡作用，为其在临床的进一步应用提供了实验基础。 本实验结果显示：一定浓度的藏红花素在体外用作用于 胞后，可见各个 浓度药物组细胞出现细胞核明显固缩、凝聚和断裂，并出现凋亡小体， 胞凋亡率随着药物浓度的升高而增加，但在 10mg/物浓度下凋亡率反而呈下降趋势，表现为细胞坏死。这就提示了较低浓度的藏红花素能诱导白血病 高浓度的藏红花素对 胞坏死大于细胞凋亡。 已知的大量的研究资料显示，启动和传导细胞凋亡需要多种基因及其产物参与。最近，关于凋亡基因调控的研究逐渐增多，也取得了明显成果。已经发现细胞内有三类重要的蛋白家族，它们分别是： 在线粒体水平调控细胞凋亡的 族蛋白；主要通过起始 平起效的 族蛋白；通过控制效应 平 of 族蛋白 。其中白家族研究最为迅速，在人类已发现 16 个家族成员，可分为促凋亡和抗凋亡蛋白两大类：天然 白多为病毒特异的基因产物，如牛痘病毒的 有抑制 性的功能； 新发现的 族成员，因而倍受重视，研究发现它广泛地