【毕业学位论文】（Word原稿）miR-133b在胃癌组织的表达与临床病理参数

兰州大学硕士学位论文 - 1 - 前 言 胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，全球范围内，胃癌居恶性肿瘤第 4 位，病死率居恶性肿瘤第 2 位 1。据估计全球每年大约 70 万人死于胃癌，每年有 90万胃癌新发病例。据统计，世界每年新发胃癌病例约为 934000 例，其中有三分之二新增病例分布在发展中国家（中国占 42%），尤以日本、中国及其他东亚国家高发 ,且世界每年因胃癌死亡的病例约有 700000 例 2。在我国胃癌发病率居恶性肿瘤第二位，每年有近 30 万人死于胃癌，另有 40 万新发病例 3,4。胃癌的发生发展是多因素、多步骤进行性发展的过程，涉及基因及蛋白 质层面众多肿瘤相关因子的异常表达及功能改变，对这些异质性的分子事件进行深入研究是发现新的肿瘤治疗手段及治疗靶点的重要方法。因此，探索胃癌侵润转移的机制，并依此进一步研究胃癌的治疗策略与靶点，积极需找一种新的具有高敏感性和高特异性的肿瘤标记物对胃癌诊断及治疗及病情监测都具有显著现实意义。 近 20 年多中心大样本的研究发现 多种疾病中存在差异表达，尤其 多种肿瘤的发生、发展过程相关，参与包括凋亡、增殖、分化、侵袭转移等多种生物学过程。 过与靶 碱基配对，调节基因的表达从 而发挥癌基因或抑癌基因的作用。 胃癌的发生发展存在显著的关联，因此 胃癌的表达及作用机制的研究成为新的研究热点。 1. 述 微小 一类普遍存在于多种动、植物体内，长约 19核苷酸非编码蛋白质的进化高度保守的单链小 为重要的转录调节因子参与基因的表达。 1993 年 5 首次在秀丽隐杆线虫（ 变体中发现了一种控制细胞发育时序的长度为 22 的转录产物在幼虫的 期表达，调控秀丽隐杆线虫由 化。 早被认为是小反义 一种调控 6,7于 2000 年在线虫中发现了 是与 似的具有转录后调节功能的小分子 在线虫的 期表达较少，在 和成虫期表达较高。 发现以及其广泛的保守性使其被称为 小时序性 因此早期被称为小时序 后，运用 隆和生物信息学方法，大量小分子 研究人员在多种 生物体中发现，其中大部分具有组织细胞类型特异性而不具有时序调节功能。随后，此类具有转录后调兰州大学硕士学位论文 - 2 - 节功能的小分子 称为 目前为止，已经有超过 4000 种 中人类 过 1000 个 8,9。最新的 新共收录 21264 种 中含人类 219 种 ()。 1.1 大多数 数位于蛋白质编码区或其它转录元件内含子上。 先， 在细胞核转录而成的几百至几千个核苷酸的初级产物即原始 括 7个发夹茎环状结构，可生成不同的成熟 录后，在细胞核内 510。 端带有磷酸基团， 3有 211，在胞质中， 协同作用下，剪切成 21成熟 后，双螺旋体解旋，其中一条被降解，另一条链即成熟 形成非对称 而通过结合到靶 其表达沉默。 1.2 结构及表达特点 一般认为 有以下显著的结构特征：（ 1） 泛存于真核生物中，是一组非编码蛋白质的短序列 自身不含开放阅读框（ （ 2）通常 大约为 22 个 成，其中 21度的 84%，在 3端可以有 12 个碱基长度的变化；（ 3）成熟的 单链结构，其 5端有一磷酸基团， 3端为羟基，这一特点使其与大多数寡核苷酸和功能 降解片段相区别；（ 4）多数 具有高度保守性、时序性和组织特异性 12,13,14 。如何鉴定 过程中，始终有一个问题那就是如何把真正的 具有相似大小的片段区分开来，如 。因此， 15,16提出 定义标准：（ 1） 达标准： 2被克隆或者被 测到； 短 列与基因组的上一个或多个位点精确匹配，并且这些区域不编码其他基因的成熟 如 。（ 2） 成标准： 在基因 组上有一个约 70前体，这个前体具有发夹状结构，其中一条臂含有 列，兰州大学硕士学位论文 - 3 - 发夹结构具有最低自由能，结构中不含大的内环或泡； 列及其二级结构具有进化保守性； 随着 功能的下降，前体物不断增加。其中判断标准表达 和生成 是必要条件。 1.3 作用机制 目前， 作用机制已被阐明，研究表明 过多种机制调控基因表达。抑制翻译是 要的作用机制。 合后，通过完全或（和）不完全的匹配方式，识别、结合靶基因的 3 而对 靶基因进行转录后的调控 17。 靶基因的作用方式主要有以下几种，第一： 3编码区域以完全互补的方式结合后，通过 用引起靶基因 解。这一作用方式在植物中常见，动物中很少见。第二： 靶基因的 3完全匹配时，不影响靶基因 是抑制其翻译，从而调控靶基因的表达 18。这种机制在哺乳动物中常见，但在植物中也存在。新近的研究表明将 胞浆转运至 能是挥调控靶基因作用的另一种机制 19,20。 有广泛的基因调控功能，参与调控包括增殖、凋亡、分化、形态发生等一系列生命活动过程，且与肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示，一个 以调控多个靶基因，不同的 可调控同一个 研究分析，只占人类基因 1%的 0%的蛋白质编码基因 21。因此， 其调控的靶基因形成复杂的调控网络，广泛参与各物种的生命过程。 1.4 命名 随着检测手段的不断发展，更多的 此，研究人员对 命名。 子简写为 的形式，阿拉伯数字代表其被克隆的先后顺序，如 度同源的 数字后加英文字母，字母一般为小写如 不同染色体上的 列转录加工而成的具有相同成熟体序列的 在字母后面加阿拉伯数字，如同物种中同源的 同一个名字，如果一个前体的两个臂分别加工合成同一个 根据克隆的结果，在表达水平较低的 加*，如 如果 不能区分表达量的多少，可根据来源于哪个臂命名，如， 示从 3端的臂加工而来）。若 自不同的物种，则在 加物种名称的英文缩写，如来源于人的 定命名规则之前发现的 如 ，则保留原兰州大学硕士学位论文 - 4 - 来的名字 22。 2. 肿瘤的关系 成熟的 过与特定的信使 3非编码区完全或不完全配对，降解 阻遏其转录后翻译，或者指导其快速脱腺苷化等形式调节靶基因的表达，产生基因沉默 ，发挥独特的负调控基因表达的能力 23。 通过调控癌基因或抑癌基因而发挥促癌或抑癌作用，而且，在不同条件下它既可作为癌基因又可作为抑癌基因，参与多种肿瘤的形成。 关肿瘤的发生通常是由于某些特定 表达，或者某些特定的 表达或者不表达，故对 达量的调节可能对肿瘤基因治疗产生重大影响。对于发挥癌基因功能，在肿瘤中高表达的以敲减其作用。敲除 因、采用反义寡核苷酸等方法下调或抑制相应 表达， 减弱其促癌作用。而对于在肿瘤中发挥抑癌基因功能的低表达的 以采用基因治疗的方法，引入 基因序列或导入外源 高相应 表达水平，增强其抑癌作用。 大量研究结果表明 够调控多种生理学和病理学过程，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和肿瘤形成等。已有证据表明： 靶向的基因数约为基因总数的 60%，而每个 抑制上百个基因。这些效应通过调控相应的信号分子（如生长因子、细胞因子、转录因子、促凋亡和抗凋亡基因等）的表达而实现。 24,25,26,27,29,30。多种 能直接参与人类肿瘤（如胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌及淋巴瘤等）的形成。 3. 于染色体 初被认为是一种心肌和骨骼肌特异性表达的 调节肌肉发育及肌信号通路相关基因 31。最近有研究报道 32，肺癌组织中表达下调，将 拟物转染人肺癌细胞后，可促进肺癌细胞的凋亡并发挥抗增殖的作用，其作用的直接靶点可能是 因。 多种肿瘤 组织中呈低表达，表明其可能发挥抑癌基因的作用，与肿瘤的发生、发展密切相关。目前 胃癌发生、发展中的作用的研究甚少。为此，前期实验应用 片对胃癌组织及癌旁正常组织的 达谱进行分析结果显示 胃癌组织中存在差异表达，本实验应用 证，为进一步研究 控胃癌发生、发展的具体信号通路的研究奠定基础。研究发现，不同肿瘤具有特定的 达水平和模兰州大学硕士学位论文 - 5 - 式，多种肿瘤均具有特异性的 达谱，人们对不同肿瘤特定的 有助于肿瘤的早期诊断和治疗。其中部分 表达在肿瘤不同分化状态、分期及预后上也有不同变化，并可以反映肿瘤的组织来源。因此，制定不同肿瘤 达谱的基因库可能对肿瘤的诊断、治疗以及预后预测有重要意义。 兰州大学硕士学位论文 - 6 - 材料与方法 一 、材料 1. 组织样本 收集 2009 年 10 月 2010 年 4 月甘肃省武威肿瘤医院接受手术治疗的 56 例胃癌患者作为研究对象。取胃癌及其周围癌组织（距离癌灶 5上，且经 行实验研究，其中癌组织 56 例，癌旁组织 56 例，术中取材，立即放入液氮中保存后转入 长期保存。 期以 上患者均保存有完整的临床资料，包括姓名、性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、淋巴管侵犯、血管侵犯和远处转移。 56 例患者中，男性 32 例，女性 24 例，男女比例为 ，年龄在 35之间，中位年龄为 56 岁。所有患者术前均未接受过放、化疗。一般临床资料见 表 1。 表 1 胃癌组织标本临床资料 病例 例数 百分比（ %） 总数 56 性别 男 32 57 女 24 43 年龄 50 岁 18 32 50 岁 38 68 肿瘤直径 51 55 55 45 分化程度 高 /中分化 17 30 低分化 39 70 兰州大学硕士学位论文 - 7 - 远处转移 有 40 9 无 16 91 期 I/7 48 V 29 52 淋巴结转移 无 6 11 有 50 89 2. 细胞株 人胃癌细胞株 正常胃黏膜上皮永生化细胞株 购于 中国科学院上海生命科学研究院。 表 2 胃癌细胞株的来源和特征 细胞株 生物学特征 来源 正常胃黏膜上皮永生化细胞株 人类胃癌细胞株，来源于肝脏转移灶；高分化 人类胃癌细胞株，高分化 人类胃癌细胞株，来源于转移淋巴结；中分化 人类胃癌细胞株；低分化 人类胃癌细胞株；低分化 人类胃癌细胞株，来源于转移淋巴结；未分化 人类胃癌细胞株；未分化 中国 *美国 3. 主要试剂 司 8*60K) 片 ： 司 司 兰州大学硕士学位论文 - 8 - 司 司 x ： 司 6 ： 司 司 养基： 司 养基： 司 4. 主要仪器 超净工作台：苏州净化 光学显微镜： 司 倒置显微镜： 司 箱：日本三洋公司 心机：上海医疗器械七厂 500 型酶联免疫分析仪：美国 低温高速离心机 ： 德国 电子天平 ： S 400S 超纯水设备 ： 微量分光光度计： GE 司 时定量 (80)：美国罗氏诊断产品有限公司 (美国 字可调微量移液器：日本立洋 5. 主要溶液配制 按说明书使用超纯水配置，调 至 膜过滤除菌，加 10%新生牛血清、 100 U/霉素、 100 U/霉素， 4C 保存备用。 按说明书使用超纯水配置，调 至 膜过滤除菌，加 10%新生牛血清、 100 U/霉素、 100U/霉素， 4C 保存备用。 .0 g、 2O g、 . 2g、 1000纯水，调 至 121C，高压消毒 30 兰州大学硕士学位论文 - 9 - 胰蛋白酶： 蛋白酶中加入 100 ，以 至 膜过滤除菌， 4C 保存备用。 细胞冻存液： 1 2 生牛血清溶解于 7 理水： 量取超纯水 100 .1 合均匀后， 121C 高压消毒 30 然冷却后， 4C 储存备用。 注：用于 须使用干热灭菌（ 180C ， 60分钟）或使用上述方法进行 可以使用 使用的无菌水须用 免混用后交叉污染。 二、方法 1. 细胞培养 胞株用含 10%新生胎牛血清、青霉素 (100 U/链霉素 (100 U/ 养液培养，其余细胞在含 10%新生牛血清、青霉素 (100 U/ 链霉素 (100 U/ 养液中， 37C， 5% 95%空气的恒温培养箱中培养。 细胞传代 代前准备 预热培养液：在 37C 水浴锅内放入装有已经配制好的培养液、 和胰蛋白酶的容器预热。 使 75%的酒精擦拭经过紫外线照射后的超净工作台及双手。 正确摆放将要使用的容器及器械，以保证有足够的操作空间，以便操作且可减少污染机会。 点燃酒精灯（注意火焰大小）。 准备好将要使用消毒后的空培养瓶。 将已预热好的培养液、 蛋白酶溶液等取出，用酒精棉球擦拭消毒后兰州大学硕士学位论文 - 10 - 放置入超净台内。 从培养箱内取出细胞培养瓶：注意取出细胞要时旋紧培养瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 观察后将细胞培养瓶放入超净工作台，将实验用的细胞培养瓶及装培养液的 瓶口一一打开，注意所有瓶口均需在酒精灯 上消毒。 蛋白酶消化 小心倒掉旧培养液，用 洗，加入适量胰蛋白酶液，注意胰蛋白酶液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是 37C。 倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 打分散细胞 用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 将细胞悬液吸入 10 心管中。 平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1000 心 6 弃去上清液，加入 2 养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 装稀释细胞 将细胞悬液吸出分装至 2 3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5105/ 续培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 养箱中继续培养。 细胞的冻存 将生长状态较好的细胞消化制成为细胞混悬液，离心并洗涤后，加入冻存培养液中，保持细胞终密度为在 5106/5107/用吸管轻轻吹打均匀后分装至无菌冻存管中，每管加冻存液 1 1.5 火焰将冻存管熔封，标明细胞名称及分装日期，放入 4C 冰箱约 40 ，转至 冰箱约 30 60 置于 超低温冰箱中保存过夜，最后置于液氮罐中长期保存。 细胞的 复苏 细胞复苏原则为快速融化，即将冻存在液氮中的细胞快速融化至 37C ，使兰州大学硕士学位论文 - 11 - 细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 将细胞冻存管从液氮中取出后迅速放入 37C 水浴中，待其完全溶化。 用吸管将冻存管内的细胞混悬液移入 10心管中，加入 4养液，1000心 5 抛去离心后的上清液，再加入 6 培养液，并轻轻吹打将细胞悬浮，1000心 5 抛去离心后的上清液，用吸管加入 2 培养液，轻轻吹打将细胞悬浮，再将管内液体移入至己加 4 10% 新生牛血清培养液的培养瓶中。 将细胞系培养于 37C， 5% 95%空气常规培养的培养箱中。 隔夜，将培养瓶放置在显微镜下观察细胞状态。 细胞计数 原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 体操作 准备工作：取传代细胞，按照中细胞培养中的传代方法培养细胞，待长成单层后以被使用。 细胞悬液制备：用将细胞用 胰蛋白酶液消化、 洗涤后，加入培养液或 打制成待测细胞悬液。 细胞计数 A取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 B用吸管吸 5 滴细胞混悬液至一离心管中，加入 5 滴台盼蓝染液（ 或苯胺黑，在显微镜下区别活细胞和死细胞，活细胞不会被染色。 C将待测细胞混悬液吹均匀，然后吸取少量混悬液沿盖片边缘缓缓滴入，保证盖片下充满混悬液，注意不要让 盖片下有气泡，不能让混悬液流入旁边槽中。 D将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有 16 个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。 E计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数） /四个大格子细胞数 /4） 2104 说明：公式中除以 4 因为计数了 4 个大格的细胞数。 公式中乘以 2 因为细胞悬液与染液是 1： 1 稀释。 公式中乘以 104 因为计数板中每一个大格的体积为： 兰州大学硕士学位论文 - 12 - ） ） ） 11000. 提取 取试剂 ： 以从组织、培养细胞等中直接提取 20包括 5S 品在 加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层）， 集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到 验准备 防 染 解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套以口罩；使用 作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止汗液、唾液中的 解酶的污染。 品准备 所有需要使用到的玻璃器皿物品均使用含 1 去离子水 37C 浸泡超过 8 小时，包括研 钵、移液器枪头、离心管等，然后在 120C 下高压灭菌 30分钟以除去残留的 体步骤： 验样品的研磨和匀浆 癌细胞及正常胃黏膜细胞匀浆 取处于对数生成期、贴壁良好的细胞，倒出培养液，用 11 次。 每 10 平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，用细胞刮勺剥离细胞，然后使用移液枪吹打细胞使残留细胞脱落。 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪 反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置 5 兰州大学硕士学位论文 - 13 - 癌及癌旁组织的研磨 将超低温冻结的胃癌或癌旁正常组织称量 50速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。 向研钵中加入 1研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 将匀浆液转移至离心管中，室温静置 5 12,000 g 4C 离心 5 小心吸取上清液， 移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 提取 向上述步骤的匀浆裂解液中加入氯仿（ ），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡 15s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置 5 12,000 g 4C 离心 15 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出 白色中间层）。 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 15 30C 下静置 10分钟。 12,000 g 4C 离心 10 般在离心后，试管底部会出现沉淀。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75的乙醇 1 勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁， 12,000 g 4C 离心 5 了更好地控制 尽量除净乙醇）。 室温干燥沉淀 2 5 可以离心或加热干燥，否则 会很难溶解），加入 1020 l 的 溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待淀完全溶解后于 保存。 度和纯度的检测 用超微量分光光度计进行 量检测，首先用 2 1 州大学硕士学位论文 - 14 - 去离子水进行空白读数，再测样品。 读取 值并记录，读数应该在 间，并且同时读取度，不符合实验要求者均重新提取。提取 56 例癌及正常癌旁组 织、胃癌细胞及正常胃黏膜细胞的 值均在 间，符合实验要求。 3. 验 剂盒原理 该制品使用改良后的 x 过检测反应液中 的荧光强度，达到监控 聚合酶链式反应 (简称 一种体外用于放大特定 段的核酸扩增系统。 本原理类似于 天然复制过程，是在模 板 种脱氧核苷酸和引物等存在的情况下， 合酶依赖的酶促合成反应，特异性依赖于引物与模板 特异结合。整个扩增过程分三步：第一步：变性，加热使模板 链解离，使之成为单链；第二步：退火，突然降温后主要发生为引物与模板 链的互补序列配对结合；第三步：延伸，在 合酶、镁离子等作用下，按碱基互补配对与半保留复制原理，形成与模板链互补的新 。重复上述循环，经过 2 3 小时后， 扩增上百万倍。实时定量逆转录 又称之为定量 ， 为 成与 术相结合，实时定量 逆转录 结合，一条 被逆转录成为互补 以此为模板通过 行 增。可以采用微量 该试剂盒中的 合酶由于使用了 x 而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高 增 灵敏度。 合荧光检测法 与双链 以可以通过检测反应体系中的 荧光强度，达到检测 体原理见图 1。通过 与双链 过检测 以对目的基因进行准确定量，同时还可以测兰州大学硕士学位论文 - 15 - 定扩增的目的 图 1 嵌合荧光法原理图 3.2 合成 转录试剂盒制品内容 试剂盒组成内容 如下表（ 20l 反应 20 次 ）： 该试剂盒中含有合成 A）多聚尾和合成 需要的全 部试剂，可以将样品中的 过一次反应合成为 1： 当同时需要进行多个反转录反应时，应先配制各种试剂的混合液（ 中包括 等），然后再分装到每个反应管中。以减少实验操作或实验样品之间的误差。 T 酶的混合制剂，使用前要小心地离心收集到反应管底部。由于酶保护液中含有 50%的甘油，粘度 高，分取时应慢慢吸取。 200 l T 0 l 40 l 0 m) 200 l 1 1 州大学硕士学位论文 - 16 - 反转录试剂盒使用前于 保存，融解后的于冰上放置，使用后立即保存于 。 反应液的配制、分装使用新的（无污染的）无 的枪头、 ，尽量避免污染。 A）加尾反应和反转录反应 按下列组份配制反应液（反应液配制在冰上进行） 反转录反应条件 向所得到的反应液 中添加 足至 100l 。取 2l 稀释液加入到下一步的 应体系中，进行定量检测。 物合成 内参 物均购 自 司（成品）。 应 剂盒制品内容 试剂盒组成内容如下表 （ 50 l 反应 200 次） 试剂 剂量 2 10 l 2 l T 2 l 10 l1 g/l） 1 l up 0 l 37C 60 （ A）加尾和反转录反应） 85C 5 （酶的失活反应） x I（ 2 1.0 支 50 200 l 1支 I（ 50 200 l 1支 兰州大学硕士学位论文 - 17 - 注： 使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应不足。 配制反应液时，试剂于冰上放置。 制品中含有荧光染料 ，配制 反应液的配制、分装使用新的无 污染的）枪头、 量避免污染。 应液的配制 （反应液配制在冰上进行） *件 ：预变性 95C 10 1 ： 应 95C 50 0C 20： 95C 15s， 60C 30s， 95C 15s 4. 实验结果分析 应结束后分析熔解曲线，从而判定扩增 产物是否有非特异性扩增。 试剂 使用量 终浓度 x I（ 2） m 菌蒸馏水） 5l 兰州大学硕士学位论文 - 18 - 据 理，当目的基因经一定次数的扩增循环而出现指数级增长时，其激发的荧光信号即达到一定的设定阈值强度而被 荧光探头捕获，仪器即给出此时的扩增循环的次数，即扩增的目的基因出现指数增长的最低循环数。最低循环数以 Ct(表示，与反应体系中原先目的基因 来反映目的基因 始含量， 越低，目的基因 始含量越高。通过各样本的复孔取平均值，即得到样本中目的基因扩增的 作为目的 基因定量判定。根据每孔的 ，以 作为内参，使用实时荧光定量 对定量法，用 N=2-表示 胃癌细胞及组织中相对正常细胞及组织表达的倍数，此时 瘤 -（ 常。 5统计学处理 应用 计软件包处理数据，计量资料结果以均数 标准差（ X s ）表示， 采用 个样本均数之间的比较采用单因素方差分析， P 为差异具有统计学意义。 兰州大学硕士学位论文 - 19 - 结果 1 7 种胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞株中的表达 1.1 胃癌细胞的表达 每个样本重复 3 次， 内参 扩增曲线可见各样品的重复性好，各样品的扩增效率 较 一致 （见图 2,4） ；通过 内参 熔解曲线可见 物的特异性 较好 ，曲线为单峰，表明无引物二聚体扩增和非 特异扩增 （见图 3, 5）。 图 2 解曲线 图 3 增曲线 兰州大学硕士学位论文 - 20 - 图 4 参溶解曲线 图 5 参扩增曲线 1.2 胃癌细胞株的表达与分化程度的关系 结果显示： 不同分化程度的 7 种胃癌细胞株中的表达均低于正常胃粘膜细胞株 表达量与胃癌细胞的分化程度呈正相关性，胃癌细胞的恶性度越差，其表达量越低（ 表 3， 图 6）。 兰州大学硕士学位论文 - 21 - 表 3 不同细胞株中的相对表达倍数 细胞类型 2- s) P 值 / )图 6 不同细胞株中的 相对 表达 2. 癌组织中的表达 及意义 2.1 胃癌组织 及其癌旁组织 中的表达 t（ 表示 组织中的相对表达量。 越高则表明 达越低。荧光定量 果显示， 胃癌组织中的 癌旁正常组织的 为 明 胃癌组织中的表达低于癌旁正常组织，差异具有显著统计学意义（ P （见兰州大学硕士学位论文 - 22 - 图 7） 。胃癌组织相对于其癌旁正常组织的相对表达量（ N=2-N 表示的意义是肿瘤组织中 对于癌旁正常组织表达倍数。 N 1 表示肿瘤组织达水平低于癌旁正常组织； N 1 表示肿瘤组织中 表达水平高于癌旁正常组织，其中 56 例中 50 例表达下调，其中 42 例表达下调 6 例表达上调，其中上调 2 倍有 3 例 （见图 8） 。 图 7 胃癌组织及相应癌旁 非瘤 组织的相对表达量（ 图 8 胃癌组织较 相应 癌旁组织的表达倍数（ 2 2.2 胃癌组织的表达与临床病理 参数 的关系 对 56例胃癌组织标本中 癌组织 达与分化程度、 期及有无淋巴结转移有关。与性别、年龄及肿瘤大小无关 （见表 4） 。 兰州大学硕士学位论文 - 23 - 表 4 表达与胃癌临床病理参数间的关系 病例 相对表达量（ P 值 性别 男性 32 性 24 龄 50 岁 18 50 岁 38 瘤直径 51 55 化程度 高 /中分化 17 低分化 39 期 I/7 29 巴结转移