【毕业学位论文】（Word原稿）转录后基因沉默在烟草对PVY和CMV双价抗性中的应用研究植物病理学硕士论文

I 密级： 论文编号 ： 中国农业科学院 学位论文 转录后基因沉默在烟草对 价抗性中的应用研究 VY I VY 要 烟草病毒病害是烟草上的主要病害， 在我国烟草上广泛分布，且多 复 合发生。对于病毒病的防治，抗病毒育种成为最经济有效的防治手段 。但是在传统育种中存在抗病性与不良农艺性状连锁 等问题，转基因生物技术为解 决这一 问题 提供了一条可行性的路线。 基因沉默现象是上世纪末被发现的，目前对其作用机制已有了比较详细的认识，在植物抗病毒中的应用研究也已开展很多，已有的实验数据表明，利用基因沉默技术可以获得高抗乃至免疫水平的抗性，其在抗病育种中 具 有非常广阔的 应用 前景。 本 论文 是利用转录后基因沉默技术进行的双价病毒抗性转基因烟草研究。在国内首次利用病毒抑制子 b 的保守区段为靶标进行双价病毒抗性的研究。根据 的数据确定靶标序列后，利用 术克隆了国内流行株系的 段和 两靶标序列串联后以此为基础进行载体构建，通过反向中间载体和正反向中间载体得到靶标串联片段的反向重复序列结构，用其替换掉双元表达载体 成基因沉默植物表达载体 构建。将 达载体导入到农杆菌 株中。利用农杆菌介导的叶盘法转化栽培烟草 到 27 棵再生苗，用 步检测得到 11棵阳性苗。抗病性检测得到 3 棵抗性苗。本实验的技术路线与实验方法为转录后基因沉默技术在双价抗病毒中的应用提供了理论依据，为烟草 病毒病的防治开拓了新的思路。 关键词 ： 烟草 转录 后 基因沉默 价抗性 is of MV on in is is as is a to up s at of of is on in to it or by So in of is It is on of b at We b we in We We of US We We 7 We 1 we of in V 目 录 第一章 文献综述 1 述 1 烟草上的危害 1 物学特性 1 系分化 1 述 2 烟草上的危害 2 物学特性 2 系分化 2 物抗病毒基因工程进展 2 P 基因 2 毒复制酶基因 3 义 3 酶基因 3 星 3 动蛋白基因 4 物来源的抗性基因 4 默的研究进展及在植物抗病毒基因工程中的应用 4 默的作用机制 4 默在植物抗病毒中的应用 8 究的目的与意义 9 要研究内容 10 第二章 材料与方法 11 验材料 11 粒载体和菌株 11 物材料 与毒源 11 与试剂 11 用培养基和溶液的配制 11 菌常用培养基 11 物组织培养与转化常用培养基 12 用溶液的配制 12 他溶液的配制 13 验方法 14 肠杆菌感受态细胞的制备及热击转化 14 杆菌感受态细胞的制备及电击转化 15 粒 提取 15 作 17 毒的接种 19 杆菌介导的叶盘法转化烟草 19 物组织核酸的提取 19 化苗抗性检测 20 第三章 结果与分析 22 V 标序列的确定与克隆 22 标序列的确定 22 物设计 22 标序列的克隆 22 扰载体的构建 25 的片段的串联 25 间载体的反向连接 27 间载体的正向连接 28 物表达载 体的构建 29 草的遗传转化 31 性检测 32 第四章 讨论 34 标序列的选取问题 34 标序列的同源性问题 34 4.3 体的选用问题 34 因的替换问题 34 建双价载体的问题 34 化苗的抗性问题 35 因沉默技术的应用问题 35 第五章 结论 36 参考文献 37 致 谢 43 作 者 简 历 44 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 马铃薯 Y 病毒 瓜花叶病毒 草蚀纹病毒 椒轻斑驳病毒 麦黄矮病毒 录后基因沉默 链 导的沉默复合物 NA 导的 基化 分子干扰 NA 赖 合酶 毒诱发的基因沉默 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 国内 目前在烟草上发现的病毒病有 16 种， 烟草病毒病 是烟草上危害最重的病害，而 马铃薯 , 黄瓜花叶病毒 (主要的病毒种类。生产上对病毒病的主要防治措施是综合防治 ， 抗病毒育种 的使用 最为经济有效， 但是传统育种的时效和各种弊端，远远满足不了实际生产的需要。随着生物技术的发展，抗病毒基因工程从某些方面弥补了传统育种的不足，极大地提高了防治病毒病的效果。 随着研究的深入 ， 新兴的基因沉默技术在植物抗病育种应用中的优势也日渐明显 ，成为抗病研究领域的热点之一。 述 烟草上的危害 1931 年在马铃薯上首次发现，此病毒可为害烟草、马铃薯、辣椒等多种作物，在烟草上引起的病害又称作脉坏死病、褐脉病、黄斑坏死病等。在东北烟区、黄淮烟区和西南 烟区都有不同程度的发生，尤其在烟草与马铃薯等蔬菜混种地区更为严重。病害造成的损失与烟草被侵染时期及病毒株系不同而异，如在移栽后 4 周内感染 坏死株系，可导致绝产绝收，如感染弱毒株系或在近收获期感染，则减产相对较轻。 毒病除引起产量损失外，更为严重的是病叶烤晒后色泽和烟味较差，降低烟叶的品质。 物学特性 马铃薯 Y 病毒科 (铃薯 Y 病毒属 (典型成员，粒体为微弯曲线状，粒体的外壳蛋白 (单一多肽链 构成，从空间结构上看，该肽链折叠成三个球状的结构域： N 端、 C 端和抗胰蛋白酶的核心区。基因组为一单链正义 5端是以共价键结合的基因组结合蛋白 ( 3端有 )尾巴，整个基因组只有一个开放阅读框架 (首先表达成一个大的多聚蛋白，通过自身编码的蛋白酶加工成为成熟的外壳蛋白和至少 7 种非结构蛋白 ，以此完成病毒的正常世代循环 。 系分化 在着明显的株系分化现象。据不 完全统计，各国报道的株系有： N、 17 个株系。 981)根据在白肋烟、三生 、洋酸浆 等鉴别寄主 上的系统和局部症状，将 为若干株系组，最主要的是普通株系 (点刻条纹株系 (烟草脉坏死株系 (在我国由于不同烟区的气候环境差异，各烟区的株系分布也有所不同， 吴元华 (1992)将东北烟区的 毒分为 坏死株系 (茎坏死株系（ 四个株系 ，王劲波 等 (1998)将 山东烟区 分为 两个株系： 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 述 烟草上的危害 1916 年首次发现，是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的 植物病害之一。上世纪 80 年代后期以来，一 直是黄淮烟区、华南烟区及西北一些省份的花叶型病毒病流行毒源。 由 70 多种蚜虫传播，在烟草上主要靠桃蚜和其他几种蚜虫传播，随蚜虫的迁飞而流行。该病毒病的流行速度快，常在移栽到团棵期发生，造成烟苗早期发病，影响生长，严重减产。 物学特性 雀麦花叶病毒科 (瓜花叶病毒属 (典型成员。病毒粒体为近球形的 20 面体，基因组由三分体的单链正义 成，即 有复制酶基因，分别编码 111 97个蛋白，介定侵染寄主植物的症状表现、种传、对温度的敏感性和卫星 相互作用， 3a 基因和 因，编码一定的蛋白和 病毒的虫传特性、寄主范围、症状表现及血清型有关。 卫星 1977 年首次发现的，由 355 个核苷酸组成的线 状 子，有两个顺反子，包装在 外壳蛋白内，对 复制有一定的抑制作用。 系分化 株系分化十分复杂，且分离物不断增加，目前的研究基本局限于某一作物 (如烟草、辣椒或番茄等 )或几 种作物 (如几种豆科作物、蔬菜作物 )，及其在不同寄主植物上的症状反应来区分株系和亚组。由于不同学者采用的不同的鉴别寄主和测定条件，使得株系的划分目前尚不统一。在烟草上陈保善等 (1996)将 88个广东 烟草坏死株系 (烟草黄色坏死株系 (谢 联 辉等 (1994)将 465 个福建 离物分为普通株系(黄化株系 (烟草坏死株系 (王劲波等 (1998)将山东的分为普通株系 (坏死株系 (黄化株系 ( 物抗病毒基因工程进展 P 基因 1986 年 用烟草花叶病毒的 因构建植物表达载体并导入到烟草中，获得第一例抗病毒的转基因植株，开创了植物抗病毒基因工程的先河。之后又获得了烟草条纹病毒 (烟草脆裂病毒 (烟草脉斑 驳 病毒 ( 病毒 因的转基因抗病植株。由 导的抗性效 果随病毒类型和病毒株系的不同而各异，此外还与 因的性质、插入位置、拷贝数、 达部位及病毒复制部位有关。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 毒复制酶基因 复制酶基因是由病毒编码的，是一种依赖于 合酶，其核心功能是合成全长的病毒基因组 (1990)首次用病毒的复制酶基因转化植株，将 系核苷酸 3472 对应 列 (据推测该序列编码复制酶的一种组分 )转入到烟草中，并获得高水平抗性的转基因烟草。之后 又 获得了豌豆早枯病毒 ( 病毒复制酶基 因的转基因抗性植株。与转 因策略相比，转复制酶基因策略具有自身的 优点 ：抗性对病毒粒子和裸露的病毒 有效，且抗病水平为高抗或免疫；对高剂量接种也有抗性；抗性持续时间长，不受高温影响，且具有明显的株系专化性，既可以在 平表现抗性，又可以在蛋白水平表现抗性，通过抑制病毒的复制和扩散而实现对病毒的抗性。 义 反义 指能与 基互补配对的单链 原核生物中反义 与细胞内基因的表达调控。这种调控是通过反义 列互补导致翻译水平上的抑制，或者与 编码区如 游序列形成复合物，导致 活或者在转录水平上起作用。以此根据植物病毒基因组设计相应的反义链导入到植物中，但是获得抗性却不理想。主要原因可能是反义 植物体内的表达水平 与病毒 亲和程度有关 (郭兴启等， 1999)。 酶基因 核酶 (一类具有催化功能的 子，广泛存在于自然界中，任何生物乃至类病毒 可以作为核酶的底物，不仅具有序列专一的切割、连接及反剪切的功能，还具有其他多种蛋白酶催化反应的功能。 根据核酶的生物学特性，人工合成的核酶可以在体外成功切割靶序列。在植物抗病毒方面人工合成了切割 马铃薯卷叶病毒 (， 1990)、 政皑等， 1992)和马铃薯纺锤块茎类病毒 (叶寅等， 1992)的核酶。但是抗性实验表明核酶基因介导的抗病性效果很低，跟反义 导的抗性效果相仿。 星 星 依赖于病毒才能复制的一类低分子量 核苷酸序列与辅助病毒以及寄主植物都没有同源性，能够干扰辅助病毒的复制并改变其症状表达。卫 星 病毒侵染的症状有的可以减轻有的可以加重，植物抗病毒基因工程可以利用减轻症状的卫星 期对卫星 利用是用 成生物制剂进行防治，随着生物技术的发展，以 卫星以有效控制 毒株系的症状为依据， 1986 年 首次将 星 转基因植株； 1988 年田波等将 星 入到烟草、番茄和青椒中，在国内首次培育出抗 转基因植株。转卫星 植株 ， 卫星 需低水平表达就可以，病毒侵入后卫星 激活和扩增，但 是由于减轻症状的卫星 突变为加重症状的潜在危险， 使其应用受到一定的限制。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 动蛋白基因 大部分的植物病毒都可以通过胞间连丝和维管束系统在植物体内传播，病毒在胞间传播受自身编码的运动蛋白 (寄主因素 影响 。运动蛋白与病毒核酸结合 ， 通过由其修饰的胞间连丝完成胞间运动。 (1995)将 运动蛋白基因缺失后导入到烟草中，转基因植株不仅对 抗性，还对其他的病毒如 也有抗性。一般认为是缺失型运动蛋白与胞间连丝上的正常运动蛋白 结合位点结合，使正常的运动蛋白不能与胞间连丝作用，而不能完成胞间运动，从而达到防治的效果。 物来源的抗性基因 植物与病毒的协同进化过程中，会形成一些针对病毒侵染的抗性基因 ， 并编码相应的蛋白。目前应用植物源抗性基因的抗病毒基因工程主要有： 1）、植物的 商陆 抗病毒蛋白 (因： 商陆 叶片中的一种小分子量糖蛋白，可以抑制病毒活性，具有广谱抗性。 (1993)人将 因导入到烟草中发现，转基因植株可以抵抗多种不同病毒的侵染 ； 2)、N 基因： N 基因是与烟草过敏性坏死反应有关的基因，大多数过敏性坏死反应都是单基因控制的，而且易克隆，因此应用相对方便，目前相关的研究很多，将 N 基因转入到植株中，就可以赋予植株对病毒的过敏性坏死反应，阻止病毒的进一步传播扩散； 3)、病程相关蛋白 (因：是由于植物受到病原物侵染 后 机体做出反应而编码的一系列蛋白，但是病程相关蛋白的具体作用机制目前还不是很明确，且病程相关蛋白基因转化植物的抗性水平也不是很理想。 默的研究进展及在植物抗病 毒基因工程中的应用 默 (针对寄生 度序列特异性的有效监督系统，是由同源的转基因、 毒、双链 转座子等诱导，通过一系列特异性的作用抑制靶标基因表达的一种生物学现象 (2005)。 默首先在转基因植物中发现的， 1990 年，人将查尔斯酮合成酶基因 (入 到紫花矮牵牛中，旨在加深花色，实验结果却恰恰相反， 42%的转基因株花色非但没有加深，反而变成白花或者是紫白相间，进一步研究表明，导入的 内源的 表达都受到抑制。随后的研究表明在包括真菌、植物和动物的大部分乃至全部的真核生物中都存在 默现象。 默在不同的研究领域有着不同的名称，在植物 中 称 为 共 抑 制 (或 转 录 后 基 因 沉 默 (1996; et 2001)，在真菌中称为基因压制 (et 1996)，线虫和动物中称为 扰 (et 1998)。 默的作用机制 因沉默的诱导子是一类核酸分子，通过序列特异性碱基配对来确定其靶标基因，作为 子需要满足两个条件：一是含有特征性结构的序列，该序列与靶标基因同源或互补；另一个是要有一定的长度 ( , 2001)。目前研究最为透彻的诱导子是中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 5 可以通过双向转录、反向重复序列和发夹结构序列转录、注 射浸泡机械导入和饲喂表达 D, 2005)。 8得到最佳抑制率则应大于 150 et 2001; M et 2001)。 发的效果随其浓度的增高而增强，但是过量的 会抑制 默效应。 胞浆内的 核酸内切酶 割成 21小分子干扰 有 1 合域、一个螺旋结构域、一个催化结构域和一个 有将长链 割成 功能 ( et 2001;et 2002; et 2002)。 降解 过程中，是以二聚体的形式存在的，有四个复合的活性中心，降解 有两个活性中心失活，使得降解按一定的位置间隔进行，此间隔的大小为 22 个核苷酸，也就说每隔 22 个核苷酸 在 切割一次。 结构上的细微改变就会引起活性中心间隔大小的改变，所以不同生物的 生的 小有一定的差异 (et 2002; et 2001)。 族蛋白在进化上非常保守，但是不同生物中的 有差别。在哺乳动物、线虫和裂殖酵母中只有一种 果蝇中有两种，在拟南芥中有四种 et 2002)。拟南芥中的四种 功能 各不相同： 于核内，参与 不完全配对的茎环结构 前体 的加工； 布于核内和胞浆中，参与一些病毒的 工； 于核内，参与合成指导转座子和内源基因位点外在修饰的 定位目前还不清楚，与 形成有关， 用于编码蛋白的 与转录后基因沉默过程 (et 2005; 2004; et 2004; et 2005)。 由 割产生的 一种 3端带有突出碱基的双链 体，每条链 5端带有磷酸基团， 3端带有羟基基团，如果任意一端被修饰或成为平末端， 不能有效介导 默 (et 2002)。在植物中 长度分为两类： 21 24种，其功能也不同： 21nt 导的沉默复合物 (作用下降解靶标24nt 指导系统沉默和 导的 基化 (NA et 2002; et 2003; et 2005)。 组装 一个多组分的蛋白复合体，具有核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶及寻找同源序列的活性 (2000)， 其主要的组分是 白，含有 个结构域，构域有 合活性， 构域在氨基酸序列和二级结构上与核酸内切酶 V 相似(et 2002; et 2003; et 2004)。 白在进化上非常保守，在大部分的原核生物和真核生物中都有分布，例如线虫中的 蝇中的 拟南芥中的 装的核心是 的载入。在果蝇中 与 加工和 组装 (et 2004)， 入复合物 (前体 结合，启动 组装。 有 白及 合域。 默所必需的，与 组装和