【毕业学位论文】（Word原稿）水稻白叶枯病菌△gacAxoo和△fleQxoo突变体基因芯片转录谱分析植物病理学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 水稻白叶枯病菌 NA NA I 摘 要 水稻白叶枯病是由 黄单胞 菌 水稻 致病 变种 (简称 起的 、严重危害水稻生产的 一种细菌性 病害。 通过 对 病相关基因的研究，使 人们 对 病机理以及与水稻互作 的 分子基础 有了不少认识 。然而， 病机制非常复杂，许多毒性和无毒机制目前仍不得而知 ，致病 基因表达调控 及其 网络 尚不清楚 。 前期研究 已 鉴定出 应答调控因子 鞭毛基因簇转录调控因子 它们 参与病菌毒性和鞭毛 运动性 的调控 。为了进一步从基因组水平上阐明 调控作用及其机理，本研究利用基因芯片技术，比较分析了 生型菌株 基因转录谱，旨在发现 录调控元 (为全面揭示 利用 株 基因组序列信息，选择出 560 个致病相关基因、调控因子基因、特有基因和保守基因、以及鞭毛基因簇基因，点制了一批 因芯片 。 对在丰富培养基 ( 导培养基 ( 生长到对数生长期 ( 其突变体 录谱进行了比较测定 。 与 养条件相比， 培养时有 17 个基因发生了差异性表达，其中 10个基因上调表达， 7 个下调表达。在 10 个表达上调的基因中， 7 个为 其效应子 (因，其中 调表达最为显著，可达到 13 倍。 养条件 的诱导。 与 培养时有 28 个基因发生了差异性表达，其中 17 个基因上调表达， 11 下调表达。在 17 个表达上调的基因中， 1 个为 因， 7 个为假定蛋白的基因。这些基因受到 调控而抑制表达。在 11 个表达下调的基因中， 1 个为 族成员基因， 1 个 应子基因 4 个为鞭毛基因 ( 控 了 应子基因 表达， 而且 也通过正向调控了部分鞭毛基因的表达，影响毛运动性 。此外， 可能通过正、负向调控 族成员基因，影响第二信使 代谢，从而调控了 诸多生物学性状。 与 培养时有 16 个基因发生了差异性表达，其中 12 个基因上调表达， 4 个下调表达。在 12 个表达上调的基因中， 4 个为 其效应子 (因， 3 个为胞外降解酶 ()基因， 3 个为鞭毛基因簇 (因， 1 个为 族成员基因， 1 个为 O 抗原生物合成基因 (这些基因的表达受到 调控而被抑制。 4 个下调表达的基因包括鞭毛蛋白基因 胶 酯 酶基因和蛋白酶基因。 析验证了 因的表达显著地受到 调控。值得注意的是， 因自身的表达在 非常显著，而在 本不表达或表达量极低。结果表明， 因表达可能受到自身的抑制。 总之，本研究利用基因芯片技术，通过构建 其 基因转录谱，鉴别了 部分调控元和 差异性表达 的 基因 ，深入分析这些基因表达和调控的生物学信息，有助于阐明 病的分子机制。 关键词： 水稻白叶枯病菌 ； 因芯片转录谱；差异性表达基因 is of of of of oo by of oo of oo a to on a CS a of in as of To on NA of of 560 oo of of to of y3 in BY 17 10 of 0 7 of is an 3 oo 28 to be 17 of 2 7 7 of is be 2 3SS 4 of of of of or of to 16 BY in 12 of 2 22SS 3 ), 3 of be is a is of is of be In to of of us to of 录 第一章 绪论 . 1 稻白叶枯病菌研究现状 . 1 稻白 叶枯病害 . 1 基因组信息 . 1 致病性研究 . 2 异表达基因的主要研究方法 . 3 迹杂交与反向 迹杂交 . 3 异显示技术 . 4 制消减杂交法 (. 4 因表达系列分析技术 (of . 5 术 . 5 时定量 术 . 6 因芯片技术 . 6 因芯片技术及其在植物病原细菌研究方面的应用 . 6 因芯片制备与试验设计 . 6 因芯片数据分析与诠释 . 7 物病原细菌基因表达谱研究 . 8 他细菌基因表达谱分析 . 10 因芯片技术应用前景 . 11 研究的目的意义 . 11 术路线 . 12 第二章 因芯片的设计与 制备 . 13 2 验材料 . 13 要仪器设备与试剂 . 13 株 . 14 养基 . 14 验方法 . 14 片的构建 . 14 因的选择 . 14 制样品的准备 . 15 片的点制 . 16 样后处理 . 19 果与分析 . 20 因的选择与引物设计 . 20 增 . 20 V 片点制 . 23 第三章 其突变体致病性和细菌生长曲线测定 . 25 验材料 . 25 要仪器与试剂 . 25 株与植物材料 . 25 养基 . 25 验方法 . 26 病性鉴定 . 26 镜观察 鞭毛结构 . 26 长曲线的测定 . 26 果与讨论 . 26 病性鉴定 . 26 鞭毛结构电镜观察 . 27 长曲线的测定 . 28 第四章 水稻白叶枯病菌 . 30 验材料 . 30 要仪器与试剂 . 30 株材料 . 30 验方法 . 31 品的准备 . 31 接法标记合成 针 . 32 片杂交 . 36 片扫描 . 37 交结果数据分析 . 39 果与分析 . 39 取与反转录标记 . 39 片杂交与图像扫描 . 40 据结果 . 41 果分析 . 44 第五章 水稻白叶枯病菌 . 46 验材料 . 46 器与试剂 . 46 株材料 . 46 验方法 . 46 . 46 转录合成第一链 . 46 系及反应程序 . 47 果与分析 . 48 取与反转录标记 . 48 片杂交与图像扫描 . 49 据结果 . 50 果分析 . 51 第六章 全文结论 . 55 参考文献 . 56 附 录 . 62 致 谢 . 73 作 者 简 历 . 74 文缩略表 英文 缩写 英文全称 中文名称 分钟转速 聚酶链式反应 时荧光定量 D 密度值 毒基因 敏性反应和致病性 bp 基对 II 分泌系统 I I 型分泌系统 放阅读 框 抗生素和氰化物全局调控 二烷基苯磺酸钠 二胺四乙酸二钠盐 硫苏糖醇 脱氧核糖核酸酶 核糖核酸酶 氧核苷三磷酸 化乙锭 炭酸二乙酯 NA 热水生菌 合酶 抑制剂 胞外多糖 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 稻白叶枯病菌研究现状 稻白叶枯病害 水稻白叶枯病是一种世界性的重要细菌病害 ， 与稻瘟病、纹枯病并称为我国的水稻三大病害 ，最早于 1884 年在日本福岗地区发现。 50 年代以来，其发病范围逐步扩大，在亚洲、欧洲、非洲、南美、美国和澳大利亚都有发生；且以日本、印度和中国发生比较严重 ， 我国每年因为此病造成的水稻产量损失在 10以上 (方中达等 , 1990)。在我国， 1950 年首先于南京郊区发现该病害，如今主要发生在华东、华中、华南稻区，而在西北、西南、华北和东北部分稻区也有分布 (董金皋 等 , 2001） 。 水稻白叶枯病是由黄单 胞 菌 水 稻 致病变种 (引起一种维管束病害。病原菌通常经伤口或水孔等进入寄主维管束，沿维管束传播，再在木质部中大量繁殖，最后蔓延至整个植株，导致病害不断扩大和加重。白叶枯病在潮湿和低洼地区发病比较频繁，一般籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单 季中稻重于单季晚稻。受侵染的水稻一般减产 20严重时可达 50%，同时还会造成米质松脆，发芽率降低。如果在分蘖期出现凋萎型白叶枯，将造成稻株的大量枯死，损失会更大 (董金皋 等 , 2001)。 为水稻上一种重要的病原细菌，也是模式植物病原细菌之一。许多研究对该菌的致病机制进行了探索，已 分离和鉴定出了大量与致病性有关的基因。这些基因包括与 生有关的基因，与毒性和无毒因子的合成及调控基因，以及编码胞外酶、毒性因子和无毒因子的分泌系统组分的基因。 基因组的测序完成为鉴定与毒性有关的基因和该致 病变种特异的基因提供了基础。然而， 致病机制非常复杂，许多毒性和无毒机制目前仍不得而知。目前需要利用基因组学的方法，鉴定出其他的致病相关基因，并确定它们的功能，为更加全面的了解 致病机制提供有用的信息。 基因组信息 病原菌的基因组序列测定是了解致病机制和限定寄主范围机制的非常重要的一步。已经测定了几个植物病原细菌的全基因组序列 (两种 在 经报道了X. 柑桔溃疡病菌）和 X. 甘蓝黑腐病菌）的全基因组序列。推测了病菌与致病性相关的基因，例如由细菌产生的可以转移的效应蛋白，以及与其他生物学过程有关的基因已从这些基因组序列。因为水稻与其 它种黄单胞病菌的寄主在分类上明显不同 (单子叶植物而非双子叶植物 ） ， 决定了其与水稻的互作。 虽然已经从 由于 多致病机理至今仍不清楚 （ et 2002） 。随着 ee et 2005)中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 的全基因组序列和结构的公布和发表，为人们充分地运用功能基因组学方法和手段、开展 et 2006） 。 小为 4,941,439