【毕业学位论文】（Word原稿）北京油鸡骨髓间充质干细胞和胚胎生殖细胞重要生物学特性研究-物细胞与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 北京油鸡 骨髓间充质干 细胞 和胚胎生殖 细胞 重要生物学特性研究 I 摘 要 本 试验 对北京油鸡 胚胎生殖细胞和 骨髓 间充质干细胞 的 分离、培养 、 生物学特性 鉴定 、外源基因导入 及诱导分化 进行了初步探索 和研究 ， 得出了以下结果： 1 采用全血贴壁或密度梯度离心法分离 3060 日龄鸡胫骨的骨髓间充质干细胞， 经筛选、扩增， 在体外培养传至 第 7 代。 骨髓间充质干细胞 为 贴壁生长，形态大多为纺锤形， 少量 多角形、圆形。细胞生长曲线呈 S型， 细胞群体 倍增时间约 36h。 本 试 验共冻存 8 个个体 的骨髓间充质干细胞 ， 25 支 冻存管 。 冻存 前 、 复苏后 细胞 活率分别为 98%、 2 北京油鸡骨髓 间充质干细胞 核型分析 统计结果 二倍体染色体数目为 2n=78 ，符合北京油鸡的种属特性，遗传性能稳定；组织化学检测 糖原 检测 呈 阳 性、 碱性磷酸酶检测 呈 阴 性、苏丹 染色呈阴性，符合 组织化学特征； 免疫荧光检测显示 北京油鸡 达细胞表面标志表达 和其他物种的骨髓间充质干细胞相似 ； 微生物检测结果均为阴性 。 3 脂质体介导 因转染 骨髓间充质干细胞 ， 转染后 48h96h 阳性细胞明显增多、强度增强， 1 周内有较强表达， 转染率 最高可达 40%。 4 体外 培养 鸡骨髓间充质干细胞在地塞米松、 抗坏血酸 诱导 下， 以 及与 骨组织共培养 条件下 ， 分化为 成骨细胞，具有成骨细胞的形态特征， 碱性磷酸酶活性提高， 茜素红、四环素标记检测呈阳性。 5 分离孵化 胚生殖腺中的原始生殖细胞，原代与生殖 腺 细胞共培养，继代采用鼠胚成纤维细胞饲养层培养，获得的胚胎生殖细胞克隆体外培养传至 第 7 代。北京油鸡胚胎原始生殖细胞含大的细胞核和相对较少的胞质，核仁不明显； 胚胎 生殖 细胞克隆呈规则的岛状或 其他 集落状生长，多层分布。 本实验共冻存 10 个个体 胚胎 生殖 细胞 ， 30 支 冻存管。 冻存 前 、 复苏后 细胞活率分别为 、 。 6 北京油鸡 胚胎生殖细胞 经染色体核型分析、细胞组 织化学鉴定、免疫荧光检测、微生物检测，证明所培养细胞为 胚胎生殖细胞 ， 符合北京油鸡的种属特性，遗传性能稳定 ；培养物生长状态良好，未受细菌、真菌、支原体污染。 7 脂质体介导 光蛋白报告质粒转染鸡 原始生殖细胞 ， 转染后 24h 阳性细胞 最多， 转染表达率 约 为 8 体外 培养 胚胎 生殖 细胞 克隆 可在 维甲酸 诱导下分化形成类胚体及多种形态细胞；添加地塞米松、 抗坏血酸后 可诱导 分化 为成骨细胞，茜素红染色 呈 阳性 。 关键词 胚胎生殖细胞 骨髓 间充质干细胞 生物学特性研究 o of on of of as 1 be 060d by or to be in th In 5 8%, 2 by no in is kp 3 by of 8h96h,0%, 4 of 5 by 5.5 of . in as G to th a to 8 5 6 G by no in is G to AS 7 EG by of 4h, 8 G be to of - be by 录 英文 缩略表 . 1 第一章 引言 . 2 髓间充质干细胞及胚胎原始生殖细胞研究进展 . 2 细胞的分离培养 . 3 细胞的形态特征及鉴定 . 4 细胞的多项分化潜能 . 5 细胞的基因修饰 . 7 细胞的应用前景 . 8 国畜禽遗传资源保存概况 . 11 禽遗传资源概况 . 11 方畜禽遗传资源保存技术 . 12 细胞与遗传资源保存利用 . 14 第二章 北京油鸡骨髓间充质干细胞生物学特性研究 . 15 验材料 . 15 验动物 . 15 要仪器设备 . 15 要试剂及配制 . 15 验方法 . 16 充质干细胞的分离培养 . 16 胞生物学特性检测 . 17 源基因转染间充质干细胞 . 19 充质干细胞体外成骨诱导分化研究 . 20 果与分析 . 21 种方法分离 比较 . 21 胞形态学 . 21 长动力学 . 21 型分析 . 23 生物污染检测 . 24 胞组织化学 鉴定 . 24 胞表面标志免疫荧光检测 . 25 源基因转染间充质干细胞 . 25 充质干细胞体外 成骨诱导分化研究 . 28 论 . 30 髓间充质干细胞的分离 . 30 胞形态及生长特性 . 30 间充质干细胞的鉴定 . 30 色荧光蛋白基因转染间充质干细胞 . 31 充质干细胞成骨诱导分化研究 . 31 第三章 北京油鸡胚胎生殖细胞生物学特性研究 . 33 验材料 . 33 验动物 . 33 要试剂及其配制 . 33 验方法 . 34 养层的制备与处理 . 34 胚 分离培养 . 35 胚胎生殖细胞生物学特性检测 . 35 光蛋白基因转染鸡胚胎生殖细胞 . 35 胚胎生殖细胞诱导分化研究 . 36 果与分析 . 37 胞生长行为特征 . 37 型分析 . 39 生物污染检测 . 40 织化学鉴定 . 40 胞表面标志免疫荧 光检测 . 40 源基因转染胚胎生殖细胞 . 41 胎生殖细胞的诱导分化 . 42 论 . 43 响 离与培养的因素 . 43 G 的生物学特性鉴定 . 43 源基因导入 . 43 第四章 全文结论 . 44 京油鸡骨髓间充质干细胞生物学特性研究 . 44 京油鸡胚胎生殖细胞生物学特性研究 . 44 参考文献 . 46 致 谢 . 52 作 者 简 历 . 53 1 1 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 l 性磷酸酶 AS 体干细胞 髓间充质干细胞 性成纤维细胞生长因子 ,6氨基苯基吲哚 s s 限量 养基 甲基亚砜 胚体 EC 胎瘤细胞 二胺四乙酸 ES 胎干细胞 EG 胎生殖细胞 牛血清 纤维集落生成细胞 牛血清 血干细胞 细胞团 血病抑制因子 s 高碘酸希夫氏反应 酸缓冲液 代鸡胚胎成纤维细胞 代鸭胚胎成纤维细胞 始生殖细胞 代鼠胚胎成纤维细胞 细胞生长因子 胎阶段特异性表面抗原 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 第一章 引言 髓间充质干细胞 及胚胎原始生殖细胞 研究进展 1999 年，美国科学杂志将干细胞 （ 究评为世界十大科学成就之首 ， 之后，干细胞又数次入选世界十大科技成就。自此，干细胞领域持续成为国内外医学和生物学研究的热点。 干细胞是指具有自我更新能力和向多种细胞分化能力的细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞（ 成体干细胞（ 胚胎干细胞根据来源和发育阶段不同 ， 分为：胚胎癌细胞（ ： 是从自发或诱发的生殖细胞瘤即畸胎瘤中分离出的一种多能性干细胞；胚胎干细胞 ： 是从附植前早期囊胚或桑椹胚经体外抑制分化培养后分离克隆的一种多能性干细胞；胚胎生殖细胞（ 将胎儿生殖嵴等部位的原始生殖细胞（ 体外抑制分化培养后从中分离出的一种多能性干细胞。成体干细胞包括造血干细胞、骨髓间 充质干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、脐带血干细胞等。 胞的分离最先在小鼠获得成功。 1981 年 129 品系小鼠延缓着床的囊胚中分离出 胞， 胞在体外传代超过 30 代，撤除饲养细胞，悬浮培养的 后分化成各种细胞，注射到裸鼠皮下可以形成畸胎瘤，并分化成来自三个胚层的各种细胞，这是第一次从胚胎中分离到的 胞。同年， 免疫外科法分离到小鼠内胚细胞团 （ ，直接培养于 养层上，添加 胞的条件培养 液为体外分化抑制物，亦得到 胞系。随后许多研究者纷纷从不同品系的小鼠分离 胞，促进 内细胞团 和 胞增殖同时又可有效抑制其分化的培养系统的建立等方面做了大量的工作。到目前为止分离小鼠 胞的技术方法己基本成熟 。 骨髓 间充质 干细胞 （ 来源于中胚层间质，形成于发育中的骨髓腔，是骨髓内除造血干细胞 （ 之外的另一类干细胞。具有向成骨、成软骨、成脂肪、骨髓基质、神经、肝 脏甚至胰岛和心肌等多种细胞分化的潜能。作为组织工程研究的热点种子细胞之一，骨髓间充质干细胞研究在创伤修复、组织功能重建及人工器官再造与移植等研究领域有着极为广阔的应用前景。 间充质 干细胞 （ 首先是从骨髓中被分离出来的。骨髓基质分为造血性基质和非造血性基质，造血性基质为造血细胞前体来源的细胞，主要为巨噬细胞；非造血性基质主要为内皮细胞和 其分化后代 1。早在 1867 年，德国病理学家推测骨髓中存在非造血功能干细胞， 1869 年， 实骨髓具有成骨能力。直至 20 世纪 60 年代末 ， 首次从骨髓中分离出成纤维集落生成细胞（ ，这些细胞最突出的特征是能够分化形成类似骨和软骨聚集物样集落，被称为骨髓多能基质干细胞 （ 。 后来等采用 密度梯度离心法，进一步从骨髓中分离出了一类细 胞，中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 这类细胞同源性更强，具有更强的自我更新 能力和多向分化潜能，被认为是比 纯的于 1985 年推测认为，不同成纤维细胞样集落形成单位为分化程度不同的细胞集落，多数处于分化早期的干细胞阶段。 1991 年， 结多年的研究成果及其他研究组的结论，提出间充质干细胞的概念。目前人、猪、大鼠、小鼠、兔、狗、羊等 被成功分离培养。 细胞的分离培养 类胚胎生殖细胞的分离 禽类具有 独特 的胚胎发育过程和生殖生理特点，禽类原始生殖细胞（ 源 于期的胚盘上胚层， 4 期时经下胚层移动到原条期的生殖新月部位。 10 期时进入刚刚形成的胚胎血管系统，随血液循环至生殖原基附近，穿过毛细血管壁到达生殖原基定居，并分化成精子或卵子。禽类 特的迁移路线使得研究者可以在适当的时期，方便地分离 其进行研究。 根据 起源、迁移及定居规律，可以从生殖新月区、血液和原始性腺中提取 传操作等研究。 1988）和 1989）交换鹌鹑中生殖嵴部位的 获得了供体后代 3,4。 1994）分别从生殖新月区、胚胎血液及生殖嵴部位获得 。 1997）用培养 5d 的 植后成功获得嵌合体鸡，从而第一次证明性腺 以在受体性腺中分化为有功能的配子 6。 2000）由 胚生殖嵴分离出 胞，并在体外培养了 4 个月，分别用传至 3 代和 4 代的 胞得到 3 只嵌合体鸡。 2005）采用荧光激活分类术用 记的鸡胚血液、生殖嵴成功高效地分离出了鸡原始生殖细胞 8。 髓间充质干细胞的分离 对于骨髓 中的其他细胞而言含量不高，在全骨髓中的比例约为 1:1105，并且随着年龄的增加或体质的衰弱数量逐渐减少 9。因此，将骨髓在离体条件下分离纯化 实行体外扩增就显得尤为重要。目前用于分离的方法主要有 3 种：根据与 其他 细胞的密度不同来分离的密度梯度离心法；根据细胞大小不同或根据细胞表面的一些特殊标志来分离的流式细胞仪分离法；根据的底物黏附特性来实现分离的贴壁筛选法。目前应用较广泛的是密度梯度离心技术，首先将骨髓在密度为 离液中离心，收集位于培养基和液界面部分的细胞，在含 10%胎牛血清的 培养一段时间后，根据与造血干细胞贴壁性能的差异去除未贴壁细胞，可达到部分分离纯化的目的。 目前，三维细胞培养技术也在骨组织工程中得到广泛应用： 10利用胶原凝胶载体培养骨髓间充质干细胞，发现三维的胶原网络能有效的刺激成骨细胞分化； 11采用培养液灌注造成动力性三维细胞培养环境，增加了细胞的适应生存能力及成骨功能。三维细胞培养能够有效地种植功能细胞、保持旺盛的细胞活性、最大程度地发挥细胞的功能。特别是流体力学刺激可通过 径将力学刺激转 导至细胞内发挥调节作用，能够明显增加成骨细胞增殖，总蛋白合成和 成增加。 在体外培养 条件 下生长与 其他 细胞一样， 历生长滞缓期、对数增殖期和生长平中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 台期，对细胞周期的研究显示：只有 10%的 制活跃，而大多数细胞处于 1 期，高比例的 1 期细胞暗示具有高度的分化潜能。 12对培养条件下的生长增殖进行了实验，发现成人可以在体外分裂 38 4 次，并且保持纺锤形态和成骨潜能直至细胞衰竭。细胞进行冷冻复苏后培养可传代达 15 次细胞的增殖分化潜能未受影响，但过多传代培养会降低细胞 的功能，甚至出现 调亡 。 细胞的形态特征及 鉴定 类胚胎生殖细胞的形态特征及 鉴定 胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小、核大、有一个或几个核仁、核质比例小，在体外分化抑制培养的过程中呈克隆状生长，呈单层或多层密集堆积而形成岛状、巢状群体生长状态，细胞界限不清，集落周围有时可见单个 胞或已分化的细胞 13。 测：由于 含有大量的糖原颗粒，所以 色技术是检测 胞的重要手段之一。所 用的染色液为高碘酸溶液、希夫氏试剂和苏木精。阳性染色为紫红色，阴性不着色，光学显微镜下即容易辨识。随着 发育，胞质中的糖原颗粒从均匀分布转化为极性分布，卵黄颗粒和脂滴也逐渐减少。 碱性磷酸酶 （ 性的检测： 一种单酯磷酸水解酶，它能在碱性条件下水解磷酸单酯放出磷酸，它是一种膜结合金属糖蛋白，由两个亚单位组成，其同工酶种类很多。碱性磷酸酶在早期胚胎的干细胞中含量较高，而在已分化的细胞中活性明显降低，因此它是细胞保持未分化状态的一个重要指标。根据 迁徙路线，结合 色的结果，可确定 胚胎中的分布区域。 胚胎 阶段 特异性表面抗原（ 一种糖蛋白，它的表达在胚胎发育早期受到严密的调节，当细胞分化时这些抗原的表达会出现明显变化。因此，它们是鉴定 胞分化的重要工具。但它的表达具有种属特异性，如小鼠 胞表达不表达 人类及某些非灵长类 胞，表达 阴性。在家禽的 胞和胚胎原始外胚层细胞的表面均有 14。另一鉴定 胞的表面抗原为肿瘤排斥抗原（ 常常以 为鉴定类 胞分化的重要工具。 性检测：在 胞鉴定中，还要对 录因子表达产物进行检测。 族转录因子，在分裂早期胚胎、内细胞团、原始外胚层和 具有发育全能性的细胞中表达。当全能细胞分化形成体细胞或胚外组织时， 因不再表达。 因对全能细胞未分化 状态的维持起着非常重要的作用。但 2001）尝试将此技术应用到鸡外胚层细胞中，经 测和 交发现，类 序列不存在于鸡基因组中。 嵌合体实验：能否参与胚胎发育并最终形成包括生殖系在内的嵌合体是衡量 胞全能性的另一个重要指标，将 胞注入到受体胚胎，如果该细胞具有全能性就会得到嵌合体动物。嵌合体动物可以通过皮毛颜色、蛋白质、 纹、同工酶等方法进行检测。目前真正参与生殖系传递即能产生功能性配子的嵌合体仅在小鼠上得到。 髓间充质干细胞的形态特 征及表面标志 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 光镜和相差显微镜下显示出类似成纤维细胞外观；透射电镜下可表现为两种不同的形态 结构 类型 15：一种是处于相对静息状态的细胞，核较大，椭圆形，仅含 1 个核仁，核质比大，胞质内细胞器少；另一种是处于相对活跃期细胞，细胞体积大于前者，核不规则，有核袋及核突，含 23 个核仁，核质比小，胞质中有丰富的细胞器。表面有微绒毛，可摄取大量营养物质供生长增殖所需。在相邻细胞间的部分细胞膜局部电子密度增高，细胞膜内颗粒相互融合的缝隙连接作为细胞的一种通讯结构，有利于细胞间信息的传递，与细胞的分泌、增殖、分 化相关。在胚胎发骨髓间充质干细胞形态呈成纤维样， 可聚集成均匀集落。细胞表面蛋白 呈阳性； 造血谱系标记呈阴性 16。但至今还未能筛选到 异性的标志物，尚未能建立鉴定 统一标准。 对 细胞周期 研究显示，只有少数 在活跃地复制 （ 大约有总计 10%处于 S+期 ） 而大多数细胞处于 1 期。细胞周期每个阶段的检控点和时间跨度均不明确，高比例的 1 期细胞暗示着 有高度 的分化潜能。传代培养时 ， 达的特异性抗原有： 胞因子及生长因子：白介素 6、 7、 8、 11、 12、 14、 15、 体、 胞活素及生长因子受体： 7。 粘附 分子 :整合 素 合素链 11皮素、 胞外基质：胶原 、蛋白聚糖、纤维结合素、透明质酸聚糖。 此外， 身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白介素和化学激动因子 （ ，但除细胞因子 （ 是持续性产生外，其他的仅仅在受到刺激后表达 。能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质 胞 中特别有关的是对 表达 .。 多种配体的受体，其分别在骨、骨 髓中对细胞外基质构建起着重要的作用 18。这些资料还表明 骨髓中有助于骨髓基质的形成和发挥功能。虽然经过大量努力，目前仍然无法分离出特异的细胞表面标志，从表面标志纯化、鉴定 方法还有待进一步研究。 干细胞的多项分化潜能 类胚胎原始生殖细胞的 诱导分化 胞的分化研究分为诱导一般分化和定向分化两类。前者是指加入一定的分化诱导剂（常用的是全反式维甲酸）， 胞同时或先后分化出不同类型的细胞。这反映了 胞不受 约束的自我无序发育，实际应用意义不大。目前，已从 胞诱导出神经细胞、心肌细胞、血细胞、血管和内皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。利用胞的定向分化可望在基因研究、药物开发、细胞治疗和组织器管替代治疗、发育生物学等的研究中发挥重要作用，具有十分广阔的应用前景。目前促进 胞定向分化的常用方法有： 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 6 （ 1）建立在特定细胞表面标志基础上的方法，或通过荧光激活的细胞分选法选出特定类型的细胞，进行再培养，产生特定的分化细胞；（ 2）通过设置培养条件，实现定向的细胞分化；（ 3）通过 加入 系列特异性 的标志基因实现细胞系列筛选。 髓 间充质 干细胞的多项分化潜能 源于 胚胎时期的中胚层，理论上可以分化发育成中胚层所有组织类型的细胞在适宜的微环境中能分化为已经知道 以分化为成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、成肌腱、成韧带、成脂细胞等。除此以外大量实验证明， 可跨越胚层界限分化为神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞、心肌细胞等细胞类型 19。 0等研究证明：与同， 体外培养过程中不会自发性分化；在体内外特殊的诱导环境下 特定的方向分化。在含有 10%培养基中加入适当浓度的地塞米松、 、抗坏血酸 （ 会使 成骨方向分化，诱导 1 周后可见钙盐聚集和碱性磷酸酶活性增加 410 倍；诱导 3 周细胞聚集成团，细胞体积变大、呈多角形，表达成骨特异性基因 （ 以及成骨特异性蛋白骨钙素、 型胶原等。将 心成结节，在无血清培养和加入 条件下可以使其向软 骨方向分化，诱导 3 周形成富含蛋白多糖的细胞外基质的多层细胞，组织形态学观察细胞中可见软骨细胞样腔隙结构，用单克隆抗体 测细胞表达 型胶原。在完全培养基中加入 13塞米松、胰岛素和吲哚美 辛 可以使 导 23 周，细胞中出现脂质空泡聚集， 红 油 O 溶液染色阳性；细胞表达过氧化物酶增殖活性受体 2（ 、脂蛋白脂酶 （ 和脂肪酶连接蛋白 。1等用 5氧胞苷和 理， 以分化为成肌细胞和肌管。 2等证实 以分化为心肌细胞。在 甲亚砜、 巯基乙醇、丁酸酯羟基苯甲醚的共同作用下， 快速分化为具有神经元表型的细胞；在体内实验中，将 入小鼠侧脑室也观察到植入细胞表达神经胶质蛋白 23,24。在 家族成员生长 /分化因子（ 作用下有利于将 化为肌腱，已经证明 、 7 可以在体内诱导 肌腱分化 25,26。在将 行体内移植的实验中，还发现植入细胞定植于肝脏、血管、真皮等组织并分化为相应的细胞 27。 到目前为止，体内、体外诱导 向分化的机制尚不清楚，但已经有 骨、成软骨相关机制的报道。研究表明：一些化学物质和细胞因子如地塞米松、 ,25二羟维生素 可以促进成骨特异性基因 表达 28。最近 有研究表明一种分泌信号蛋白 能参加了 成骨分化过程，研究者在对骨质疏松假神经胶瘤综合症的患者研究中发现，这种患者骨量水平低下和骨小梁减少与患者体内 通用受体低密度脂蛋白受体相关肽 5（ , 缺乏有关，患者体内骨小梁中却聚集了大量的 一步的研究表明，在小鼠实验中应用 碱性磷酸酶的活性而不影响 表达水平；阻止 达可以降低成骨 细胞的增殖