大肠杆菌生长曲线实验报告-xiang.docx

E.coli growth curve measurement一、目的1、瞭解細菌生長曲線特徵，測定細菌繁殖的代時；2、學習液體培養基的配製以及接種方法；3、反復練習無菌操作技術；4、瞭解不同細菌，不同接種方法在同一培養基上生長速度的不同；5、掌握利用細菌懸液混濁度間接測定細菌生長的方法6、複習光電比濁法測量細菌數量的方法7、學習平板塗布技術二、原理1、大腸桿菌生長：將一定量的細菌接種在液體培養基內，在一定條件下培養，可觀察到細菌的生長繁殖有一定的規律性，如以細菌的活菌數的對數作縱坐標，以培養時間作橫坐標，可繪成一條曲線，成為生長曲線（如圖一）。 圖一 微生物生長曲線示意圖單細胞微生物的發酵具有四個階段，即調整期（延滯期）、對數期（生長旺盛期）、平衡期（穩定期）、死亡期（衰亡期）。生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態。不同的微生物有不同的生長曲線，同一種微生物在不同的培養條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微生物的生長曲線對於瞭解和掌握微生物的生長規律是很有幫助的。測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數板法、平板菌落計數法、稱重法和比濁法等。本實驗採用比濁法測定，由於細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值（OD600）與其對應的培養時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線。注意，由於光密度表示的是培養液中的總菌數，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。2、平板塗布技術：塗布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用於計算活菌數，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用於檢測化學因素對微生物的抑殺效應。 原理:將一定濃度，一定量的待分離菌懸液加到已凝固的培養基平板上，再用塗布棒快速地將其均勻塗布，使長出單菌落或菌苔而達到分離或計數的目的。 其目的:用於目的微生物的分離；用於藥物的抑菌試驗；觀察菌苔的形狀和特點。 優點：可以計數，可以觀察菌落特徵，還可以進行菌種的分離。 缺點：接種前需梯度稀釋，吸收量較少，較麻煩，平板不乾燥效果不好，容易蔓延。三、材料、藥品1、 實驗材料：細菌 （E.coli）2、 培養基：LBmedium；3、 實驗儀器：光電比色計、L型玻棒、接種環、超淨工作臺、恒溫培養箱； 四、步驟1、取100LE.coli放入含有200mL LB liquid medium的錐形瓶中，並搖晃均勻。2、取mixed的菌液1mL到cuvette內，拿去測量吸光值，並記錄測得的數值。3、取500L的菌液放入LB solid medium內，並用玻璃棒塗抹均勻，放入37,150rpm的incubator內培養。4、整個實驗共進行24個小時又50分鐘，第三個小時開始用n=600nm測定細菌培養液吸光度，以後每隔一小時測一次，知道實驗結束。（若吸光值大於0.7，則代表菌液的濃度太濃，需要加以稀釋。）5、除第二盤plate相距第一盤plate1小時和第三盤plate相距第二盤plate3小時之外，之後每相隔5小時就要再新畫一盤新的plate。（第一、二盤plate沒有稀釋，第三盤plate稀釋1000X，第四、五、六盤稀釋106 X）五、實驗結果實驗數據時間Time(minutes)A600Log10A600Log2A600菌落數（個/0.1mL）17:20019:101100.019-1.7212464-5.717856888020:151750.018-1.7447275-5.795859349421:122320.021-1.6777807-5.573466922:102900.025-1.60206-5.321928123:173570.023-1.6382722-5.44222234680:134130.029-1.537602-5.10780331:054650.044-1.3565473-4.50635272:075270.084-1.0757207-3.57346693:045840.164-0.7851562-2.60823234:056450.332-0.4788619-1.59074494415:047040.521-0.2831623-0.94064476:047640.97-0.0132283-0.04394337:058251.60.204119980.678071918:068862.450.389166081.292781759:159553.110.492760391.63691458無法數清10:0510053.570.552668221.8359240711:0010606.490.81224472.6982184812:1011303.960.597695191.9855004313:10119040.60205999214:1512554.460.649334862.15704371無法數清15:0513054.40.643452682.1375035216:0513654.490.652246342.1667154417:0514254.760.677606952.2509615718:1014905.010.699837732.3248106表一 實驗數據六、討論根據表一做出以下圖圖二A600 與時間圖由圖二看出，11:00的實驗數據有顯著的異常，分析可能是由於操作的失誤造成的，應當捨棄來進行校正，修正後圖如下（以下其他圖也將做同樣校正）圖三 A600 與時間圖（修正後）一般來說，應該是說細菌的生長曲線，細菌是以二分裂方式增殖生長，也就是對數增長，是它生長的一個主要特點，故以其對數為縱坐標，更能體現這個特點，所以做出下圖圖四Log10A600 與時間圖圖五Log10A600 與時間圖（修正後）分析圖五，可知道本次實驗，E.coli的生長曲綫大體上符合邏輯斯蒂生長曲綫，即有明顯的lag phase, logarithmic phase以及stationary phase，但是沒有出現明顯的death phase。1、基本上以0-357min為lag phase。在此過程中，細菌的數量稍有波動，但是還是處於一個比較低的菌密度，沒有快速的數量增長現象。這是因為單菌落菌較少，而且從固體培養基轉移至液體培養基環境變化較大，細菌在適應新環境的過程中，並不會進行大規模的複製增長，所以數量保持在一個相對較低的水準。 可以注意到，在lag phase的階段，有一定的波動情況，分析原因可能有三：在細菌適應新環境時，出現了不適，造成了菌體的死亡，從而使數量下降由於在測定菌數的時候，菌的外界環境有所變動，例如溫度、培養液均質度等，可能使其對環境的適應產生改變，使數量改變人為的操作失誤，如取液前未搖晃至培養液足夠均勻。2、把357-886min看做是logarithmic phase。細胞在一定的環境下經過了短暫的適應期，進而快速生長的時期，此時期營養充足，細胞會以對數生長，假如原來只有一個細胞，進入對數期以後就會變為兩個，兩個再變為四個，四個變為八個.即以2的N次方的速度生長(N為細胞的分裂次數)，在對數期生長速率遠遠大於死亡速率，所以在對數期最顯著地特徵就是細胞的數目大量增加，但當細胞經過一定時間的生長會消耗掉營養物質，產生大量的次生代謝產物使得pH值下降，其生長環境變得惡劣，此時生長速度下降，生長速率和死亡速率平衡，細胞的總個數基本保持不變，開始進入stationary phase。 從圖五看，本次生長曲綫的logarithmic phase與理論符合度很高，做出下圖圖六Log2A600在logarithmic phase中與時間的關係由圖六可以看出E.coli在logarithmic phase中以0.0136 Log2A600/min的數率進行快速增殖，R square為0.9945，說明瞭此曲綫的回歸擬合度非常高，置信度很高。3、886-1490min可以看做是本菌生長曲綫的stationary phase。因為進入此期後，菌的數量增長緩慢，甚至停止，這是因為由於培養基中營養物質消耗，有害代謝產物積聚，該期細菌繁殖速度漸減，死亡數緩慢增加，生長分裂和死亡的菌細胞數處於平衡狀態。該期細菌形態、染色性和生理性狀常有改變。一些細菌的芽胞、外毒素和抗生素等代謝產物大多在最大穩定期產生。但是在圖五中看來，curve有緩緩上揚的趨勢，分析原因可能如下：其為兼性耗氧菌，因為每次進行取菌操作的時候，都會有新鮮的空氣進入培養瓶中，使氧氣得以補充，使其生長環境得以改善，使其數量繼續增加取菌操作的時候未充分搖勻，取到了菌比較多的溶液部份。4、本次的生長曲綫沒有出現death phase。Death phase是由於在後stationary phase繼續培養，細菌死亡率逐漸增加，以致死亡數大大超過新生數，總活菌數明顯下降，稱為衰亡期。在這個階段細菌常出現多形態，包括畸形或衰退型，細胞死亡伴隨著自溶。 可能是由於其生長環境還沒有足夠惡化，使它的stationary phase結束，應該要再進行一段時間的培養，才能到達這個時期。5、對於平板塗布的菌落計數，最後兩盤的plate可能是由於菌落數過多，稀釋的倍率不夠，導致經過培養後無法計數的情況，也可能是由於塗布時，未將菌液足夠擴散和乾燥，導致其生長粘連在一起，無法計數。 並且，第一盤plate菌數居然比後面2、3、4次都菌落數多，這是不符合時間吸光度測定法數據和理論依據的，可能是操作的同學沒有將菌液搖晃到足夠的均勻，導致取出的菌液不具有足夠的代表性。所以這次plate的數據僅能作為參考使用。七、實驗小結這是一個大組合作、小組分工的實驗，每一組的結果都影響了整個大組隊結果的分析，這就要求我們的合作。由於時間漫長以及其他因素的綜合影響