小球藻破壁技术研究进展.docx

小球藻破壁技术研究进展钟韵山1，徐仰仓1，2，*，荆柏林1，王晓燕1（1. 天津科技大学 海洋科学与工程学院，天津 300457；2. 天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 300457）摘 要：小球藻含有丰富的营养物质，具有多种保健功能，已作为功能食品和营养强化剂应用于食品工业。但由于小球藻的细胞壁十分坚硬，很难破碎，其内的有效成分不易释放，应用价值因此而受到了影响。因此，破壁技术是小球藻产业的关键技术之一。本文对现有的各种破壁技术进行了综述，并在此基础上提出一些自己的想法。关键词：小球藻；细胞壁；细胞破碎Research Advances on Chlorella Cell-breakage TechnologyZHONG Yun-shan1，XU Yang-cang1，2，*，JING Bo-lin1，WANG Xiao-yan1（1. College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & technology，Tianjin 300457， China；2. Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry，Tianjin 300457，China） Abstract：Chlorella contained plentiful nutrients， and it had many healthcare functions. Now chlorella has beenapplied in food industry as functional food or nutrition fortifier. However， the cell wall of chlorella was very hard so that it was difficult to break， and the activate component in cell was difficult to release. All of these restricted chlorella application. Therefore， the cell -breakage was one of the key technologies in chlorella industry. This paper reviewed various cell-breakage technology of chlorella and gave some own ideas.Key words：Chlorella； Cell wall； Cell-breakage小球藻（chlorella sp.）是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门绿藻纲卵囊藻科，现已被广泛养殖。在良 好条件下生长的小球藻，其藻粉具有很高的应用价值，蛋白质含量可达 63.60 %，同时还含有一些糖类和 脂肪，其中不饱和脂肪酸的含量较高，且含有二十二碳六烯酸（DHA）1。我国常见的小球藻种类有蛋白核 小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。杨鹭生等2测定 了 神 舟 生 物 工 程 有 限 公 司 批 号 为 20010402、20010412、20010422 的蛋白核小球藻的蛋白质、氨基酸 含量。其结果表明，蛋白质含量高达 63.36 %63.98 %，氨基酸含量为 55.95 %，必须氨基酸含量为 23.35 %。小球藻具有特殊的功能成分小球藻活性生 长因子（CGF），也叫小球藻精，它主要由氨基酸、核苷酸、多糖、蛋白质、维生素等功能性成分组成3。CGF 是生理活性物质，其生理功能表现为：抗衰老、活化人体细胞；激活淋巴细胞，增强巨噬细胞吞噬能力，有效抑 制变异癌细胞的生长、增强机体的免疫能力，抵抗外来病毒入侵；减轻因药物等有机物、铅、砷、汞等重金属 造成的毒害，恢复肝、脾、肾等脏器的排毒功能；防治胃溃疡、改善肺的呼吸功能，促进人体受损伤组织的修 复；平复高血压、高血糖、高血脂和心脑血管疾病；促使 人体肠道中双歧杆菌和乳酸菌迅速繁殖，具有调节肠道内群落作用4。目前小球藻已广泛应用于食品添加剂、动物饲 料、美容以及医药保健等领域。在美国和日本将小球藻作为优良食品和动物饲料添加剂已有 30 多年的历史5。近年来，我国开始重视小球藻的开发利用，但是 小球藻的破壁技术一直是个难题。小球藻虽然营养丰富，由于细胞壁难以破碎，使得其有效成分难以被提 取，应用价值因此而受到影响。本文总结了小球藻破壁方法，并在此基础上提出一些自己的想法。基金项目：国家级“大学生创新创业训练计划”项目（201210057037）作者简介：钟韵山（1992），男（汉），本科生，研究方向：生物工程。* 通信作者专题论述钟韵山，等：小球藻破壁技术研究进展1211 小球藻的细胞壁氮小球藻细胞直径约为 3 m4 m，细胞壁厚度 约为 21 nm，其质量占干重的 13.6 %。小球藻的细胞壁较厚，且十分坚硬，成分较复杂，这给破壁带来了巨大 的困难。通过电镜观察，发现小球藻的细胞壁是由两相 体 系 构 成 ：微 纤 维 和 基 质 。其 中 直 径 约 为 3 nm 5 nm 的微纤维不规则地交织在连续网络状的细胞壁 上，将整个基质包围。这些微纤维贯穿了整个细胞壁，当它们交织的时候，会沿着两个不同的方向延伸，其 夹角近似为直角。基质的外表面是颗粒状的，通过电镜检测和酶处理显示，这些颗粒主要分布在细胞壁外 表面和细胞壁内表面。Northcote 等6对小球藻细胞壁的成分进行了深入研究，利用物理破碎、差速离心等方法得到纯细胞壁， 通过凯氏定氮法测定细胞壁总氮含量为干重的 4.6 %，采用 Fiske 等7的方法测得总磷为 0.67 %。在小球藻细 胞壁中，蛋白质约为 27 %，脂质约为 9.2 %，纤维素 约为 15.4 %，半纤维素约为 31 %，葡萄糖铵约为 3.3 %，灰分约为 5.2 %。与植物细胞壁不同的是，在小球藻细 胞壁中没有检测出糖醛酸。小球藻细胞壁蛋白含量高于一般的植物细胞，这 些蛋白可能是功能蛋白，也有可能在代谢过程中参与了细胞壁的合成，或者两者都有。一些蛋白质（其中部 分蛋白质以糖蛋白的形式存在）与半纤维素交联在一起，并和多糖共同构成了大部分基质。小球藻细胞壁中半纤维素的酸水解产物为半乳 糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖。小球藻细胞壁的微纤维的结构几乎包含了所有多糖，与 纤维素化学组成相似。它主要是由葡萄糖 聚合物、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和鼠李糖构成的。中研磨的小球藻细胞壁全部破碎了。研磨法虽然操作简单，但从结果可以看出，常规 研磨法对小球藻破壁效果不理想。液氮研磨能够达到理想的破壁率，但是其成本过高，研磨时小球藻容易 溅出，因而不适合应用于大规模生产。2.2 机械匀浆法机械匀浆破壁法是利用高速组织捣碎机将细胞 破碎，其原理依然是对细胞施加剪切力，使其破壁。胡开辉等8在无菌条件下用高速组织捣碎机匀浆30 s（12 000 r/min），重复了 3 次，经过显微镜检查，发 现破壁率仅为 11 %。由此可见，短时间机械匀浆法对小球藻进行破壁不够理想。Doucha 等10对比了不同品牌、不同功率、不同容 积的匀浆器，分别进行了 30 min 以上的破壁实验，发现破壁率均在 60 %以上，随着破壁时间的延长，部分 破壁率甚至能够达到 90 %。由此，在机械匀浆破壁过程中，时间越长，破壁率越大，但当达到一定破壁 率 时，破壁率随时间延长没有明显的上升。此外，匀浆器 中填充的念珠过少，则不能达到破壁所需的剪切力；填充过多，由于念珠的相互作用显著，不能使念珠达 到适合破壁的速率分布。破壁率还与匀浆速度有关，匀浆速度越快，破壁率越高，但是匀浆过快时，会使小 球藻细胞过于分散从而降低破壁效果，同时会消耗大量的能量，使得只有不到 1 %的能量真正用于破壁，其 余的能量会使温度上升，从而导致降温所用的能量也有所上升。短时间机械匀浆法不能达到良好的破壁效果，长 时间机械匀浆虽然能达到良好的破壁率，但是能耗很大。同时，一方面，温度上升会导致一些小球藻成分变性；另一方面，匀浆时产生的强大剪切力也能使一些 小球藻成分变性。所以，虽然机械匀浆法能达到一定 的破壁率，但是由于能耗大和易破坏细胞内活性物质两方面原因，使得其在工业化生产中不够理想。2.3 交替冻融法交替冻融使细胞破碎的原理是直接将藻液置于 低温环境中，细胞内外环境中的绝大多数水形成冰晶，冰晶的形成产生了膨胀压，导致细胞产生机械损伤，同时未发生冻结的胞内残存液，由于在冻结过程 中冰晶的析出致使溶质浓缩，电解质升高、渗透压改 变、pH 改变、蛋白变性等，而溶解又会使细胞发生溶胀，最终使细胞破碎和死亡11。刘圣臣等12配制了 3 种 不同密度的小球藻液，分别在-20 进行冷冻，室温（25 ）融解，每次冰冻 12 h。最终发现，3 种不同密度 的藻液经交替冻融 4 次后，破壁率均在 50 %以上，且2小球藻物理破壁技术目前，对于小球藻破壁，物理破壁方法主要有：研 磨法、机械匀浆法、交替冻融法、超声波破碎法、高压均 质法。2.1 研磨法研磨法是将小球藻放入到研钵中，加入石英砂（使得研磨更加充分），再利用钵杵对其施加外力，在外 力的作用下使得细胞壁破碎。胡开辉等8在提取小球藻细胞活性物质时，将无菌藻泥在研钵中加少量石英砂研磨 30 min，通过显微观测，发现破壁率仅为 6 %。Hongli Zheng 等9在提取小球藻的脂肪酸时，分别对比 了在潮湿条件下、干燥条件下以及液氮中研磨小球藻时细胞壁的破碎率，通过电子显微镜观察，发现液氮钟韵山，等：小球藻破壁技术研究进展专题论述122密度对细胞破碎率的影响不大。交替冻融具有适用于高密度藻体破壁，操作简 便，不受外源性杂质污染，并且设备简单，能源消耗低，适合较大规模生产。但每次冻融需要消耗大量时间。2.4 超声波破碎法超声波破碎法应用超声波加热使细胞内的极性 物质，特别是水分子吸收了微波能后，会产生大量的 热量，从而使细胞内的温度迅速上升，细胞质就会膨胀及液态水汽化产生的压力将会把细胞膜和细胞壁 冲破，形成了许多微小的孔洞，进一步的加热，就会导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现 裂缝。孔洞或裂纹的存在使胞外溶剂极容易进入细胞内，溶解并释放胞内产物13。刘圣臣等12用 400 w 超声 波，采用每破碎 3 s 间歇 3 s 的方法，对密度分别为1.55 109 个/mL、0.85 109 个/mL、0.32 109 个/mL 的 小 球藻液进行破壁。最终 3 种密度的小球藻液破壁率均可超过 90 %，其中密度为 0.32109 个/mL 的小球藻液 经 过 12 min 后 ，破 壁 率 可 达 93.37 % ；密 度 为 1.55 109 个/mL 的小球藻液经过 24 min，破壁率也能达到90.86 %。这说明第一，随着浓度增大，超声波破壁率 有所下降；第二，超声波作用时间越长，细胞的破壁率越大。超声波破碎法的优点是具有较高细胞破壁率，同 时破壁所用的时间很短。但在处理过程中会产生局部高温现象，容易导致细胞内蛋白质变性、不饱和脂肪 酸氧化等问题，所以超声波破碎必须在冰浴的条件下进行，不太适合大规模提取。另外，不同微藻对超声波 的敏感度不同，这是由其本身结构决定的8。2.5 高压均质法 高压均质法是利用高压迫使悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击造成细胞破裂，在高压 均质器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随 之破裂，胞内产物得到释放。钟瑞敏等14将 60 复水 的小球藻于 30 MPa 压力下均质 2 次，再用 100 倍显微镜观察，细胞已全部破碎。高压均质法对小球藻破壁的效果比较好 ，但 在 操作中会产生大量的热，对一些生物活 性 物 质 产 生了破坏。3.1 酶解法小球藻的细胞壁主要成分是纤维素，采用纤维素 酶能够有效的去除小球藻的细胞壁，达到良好的破壁效果。3.1.1 纤维素酶作用机理纤维素酶是由内切葡聚糖酶（C1）、外切葡聚糖酶（Cx）和 葡聚糖苷酶（BG）构成。Reese 等15的研究 表明，纤维素降解至少包含两个步骤：一是在 C1 的作用下，纤维素水解为线性直链缩合无水葡萄糖；二是在 Cx 的作用下，水解缩合无水葡萄糖中的 1,4糖苷键形成可溶性糖。在他提出的 C1Cx 假说中，必 须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是 C1 首先进攻纤维素的非 结晶区，形成 Cx 所需的新的游离末端，然后由 Cx 从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后 由 BG 将纤维二糖水解成二个葡萄糖。后来的研究发现，这种协同作用必须是在 3 种酶 共同存在下才有催化活性，Lars 等16在绿色木霉中分离得到纤维素酶，采用葡聚糖凝胶色谱、二乙基氨基 乙基葡聚糖凝胶色谱等方法，分离得到纯净的 C1、Cx、BG。同时发现这些酶独立存在时不具备羧甲基纤 维素酶活力和 葡糖苷酶活力。随着时间推移，人们对纤维素酶降解纤维素机理的研究越来越深入，一些新的观点逐步被提出并证 实。如：氢键断裂是纤维素酶降解过程的初始、限速步骤；存在氧化性降解过程等17。3.1.2 酶解法破壁实验Hyeon-Soo Cho 等18为了从小球藻中提取脂质，用 纤维素酶对小球藻进行破壁处理。发现当 pH 为 5.0，温度为 50 时，酶解 72 h，能有效破壁，并且脂质提取 率最高，为 85.3 %。何扩等19在研制小球藻藻片时，也采用了酶解法对小球藻进行破壁处理。发现当 pH 为5.0，温度为 50 时，酶解 6 h，小球藻的破壁率为 80 %， 最佳用酶量为E/S=2 %。当酶量为E/S=4 %时，破壁率为 68 %。何扩等19又用复合酶对小球藻进行破壁实验，他 们在纤维素酶中加入了糖化酶，酶量总共为E/S=4 %，结果破壁率仅有 50.01 %。另外，他们还在纤维素酶中加入了一定量的复合酶（含有部分纤维素酶和果 胶酶），总量依然为E/S=4 %，最终破壁率为 53.66 %，都低于 68 %。这说明在纤维素酶中加入了复合酶或者糖化酶都不利于小球藻破壁。3.1.3 酶解法优劣酶解法是在较温和的环境下对小球藻进行破壁3小球藻生化破壁技术小球藻生化破壁法是利用生物过程或者化学过 程对小球藻进行破壁的方法。目前主要有酶解法和病 毒法。专题论述钟韵山，等：小球藻破壁技术研究进展123处理，不会像物理破壁法那样产生大量的热量，因此不容易导致细胞内物质变性，对于提取胞内物质十分 有益。酶解法破壁的破壁率很不错，能达到 80 %以上，基本能够满足工业化需求。酶解法是利用纤维素酶水解细胞壁，其速率取决 于酶活，通常情况下酶解法要消耗不少时间，同时，在酶解的过程中，伴随着胞内物质释放，染菌的风险也在加大。3.2 病毒法PBCV-1 是一种小球藻病毒，在它侵入宿主细胞 过程中，通过不可逆的、特异性的受体识别，吸附到小球藻细胞上，并在吸附位点将细胞壁消解掉。这说明病毒本身具有降解细胞壁的能力。张维娟等20在检测 PBCV-1 病毒颗粒降解宿主细 胞壁的活力时，发现 PBCV-1 在与宿主细胞于 22 保温一定时间 （小于 1 h），加入破坏细胞膜的离子去垢剂，即可发生细胞裂解。同时，他还发现，经过反复冻 融处理过的病毒颗粒虽然丧失了感染细胞的能力，但仍具有溶壁能力，而且与未冻融的完整病毒相比，并 无明显区别。说明冻融过后病毒，仍然具有溶壁活力。myces）、纤维素诺卡氏菌（Nocardia Cellulans）、芽孢杆菌属（Bacillus）以及纤维单胞菌属（Cellulomonas）等21。 目前，用于工业纤维素酶生产的主要是瑞氏木酶、绿 色木霉、里氏木酶、康氏木酶等。发酵法的本质依然是利用纤维素酶分解细胞壁，与酶解法不同的是，发酵法不用直接加入纤维素酶， 而是利用发酵反应产生的纤维素酶。利用发酵法进行破壁，不仅成本比酶解法低，而且小球藻细胞壁还能 作为微生物生长的部分碳源，起到了一举两得的作 用，同时还能达到较高的破壁率。发酵法还可以与微生物固定化技术、发酵培养基分批补料技术以及连续 培养技术一起应用。唯一的不足是，发酵法伴随着微生物发酵反应整个过程，所以破壁要消耗不少时间。4.3 超临界流体法 超临界流体是指物质在温度、压力高于临界温度和临界压力时所形成的可压缩性高密度流体，其密度 接近液体，黏度接近气体，具有与液体相近的溶解能力和与气体相近的扩散特性。超临界流体细胞破碎技 术是将高压 CO2 渗透到细胞内，突然降压使细胞内外压差急剧增大而膨胀破裂，对于细胞壁较厚的微生物。因 CO2 能破坏胞壁上的脂溶性成分，降压时破裂 发生在一定位置，使破碎后的细胞碎片较大，便于下游分离，同时在降压过程中流体体积膨胀，温度降低， 可防止因升温引起生物活性物质失活22。超临界流体细胞破壁技术是近几年发展起来的全新的一种破壁技术，Kyoung 等23的研究表明，经过超 临界 CO2 流体处理过的纤维素能提高纤维素的酶解 效率。辛玮等24发现纤维素与纤维素酶同时经过超临 界 CO2 流体处理，纤维素酶虽失去催化活性，但这种 处理却能提高纤维素进一步被酶解的效率。超临界流体技术广泛应用于微藻内生物活性物质的提取，能够使提取效率大大提升。但是，目前还没 有人探究采用此方法时小球藻的破壁效率。超临界流体法最大不足在于设备一次性投资较高，随着超临界 流体理论的逐步完善和设备制造工艺水平的不断提高。相信在不久的将来能够应用在小球藻破壁中。4.4 结束语小球藻破壁技术是一道世界性难题，从目前看 来，有不少方法都能够达到比较理想的破壁率，但这些方法都存在不可忽视的弊端。随着科学技术不断发展，未来小球藻破壁技术应该朝两个方向发展，一是 不断开发新的物理、化学破壁方法，以弥补原有方法 的不足；二是同时使用多种传统的物理或化学破壁方法，每种方法有自己的长处与不足，相互配合使用，能4 展望从目前的情况看来，全球范围内破壁的方法多种 多样，虽然大部分方法可以达到一定的破壁率。但不可否认的是，这些方法都存在不可忽视的弊端。因此，好的破壁方法一定需要尽可能规避这些弊端。一些新 的破壁方法也就逐渐进入人们研究范围。4.1 复合酶解法 在酶解过程中，大多数实验是直接利用纤维素酶进行破壁，但由于小球藻细胞壁成分并不仅为纤维 素，还有其他物质。所以，可以尝试采用复合酶解法进行破壁。Northcote 等4的研究表明，小球藻的细胞壁含有 不少蛋白质，所以在酶解破壁过程中，可以尝试加入一些蛋白酶，或许效果会更好。但如前所述何扩等19采 用复合酶破碎小球藻细胞壁，效果并不理想。说明复合酶解法破壁并不是简单地将几种酶组合在一起就 可以了。4.2 发酵法发酵法将微生物接种到含有小球藻的发酵培养 基中，使得微生物在发酵过程中产生的纤维素酶能够直接作用于小球藻，最终导致小球藻破壁。其中能够 产生纤维素酶的微生物主要有木霉（Trichoderma）、青 霉（Penicillum）、镰 刀 菌（Fusrium）、链 霉 菌 属（Strepto钟韵山，等：小球藻破壁技术研究进展专题论述124够起到取长补短的效果。研究J.中国食品添加剂,2009(5):100-10213 钟石,蔡守平,胡峰林，等4 种破碎方法对古尼虫草内含物提取 的初步研究J安徽农业大学学报,2005,32(1):81-8614 钟瑞敏.酶解小球藻保健饮品工艺研究J.食品科学,2002,23(9):68-7115 Elwyn T Reese, Ralph G H Siu, Hillel S Levinson. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis J. Journal of Bacteriology,1950, 59(4):485-49716 Lars E R Berghem,L Goran Pettersson. The mechanism of enzymatic cellulose degradationJ. Eur J Biochem, 1973,37:21-3017 高培基. 纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展J.自然科学进展,2003,13(1):21-2918 Hyeon -Soo Cho, You -Kwan Oh, Soon -Chul Park, et al. Effects of enzymatic hydrolysis on lipid extraction from chlorella vulgaris J. Renewable Energy, 2012,12(9):1-519 何扩,张秀媛,李玉峰.小球藻破壁技术及其藻片研制J.食品工业科技,2006,27(2):147-15120 张维娟,刘彬,刘平芳.小球藻病毒 PBCV-1 溶壁活性研究J.河 南大学学报:医学科学版,2003,22(4):16-2521 靳振江.纤维素酶降解纤维素的研究进展J.广西农业科学,2007,38(2):127-13022 肖京力,周丽莉,礼彤.超临界流体技术在生物工程领域的研究进 展J.沈阳药科大学学报,2006,23(3):192-19623 Kyoung Hk, Juan H. Supercritical CO2 pretreatment of lignocellulose enhances enzymatic cellulose hydrolysisJ. Bioresource Technology,2001,77:139-14424 辛玮,王秀道,尹卓容.超临界 CO2 流体对纤维素酶催化反应的影 响J.生物工程学报,2004,20(5):770-773收稿日期：2014-03-22参考文献：陈晓清,苏育才.小球藻的应用研究进展J.生物学教学,2012,37(1):8-9 杨鹭生,李国平,陈林水.蛋白核小球藻粉的蛋白质、氨基酸含量 及营养价值评价J