（有机化学专业论文）果仁粕蛋白的提取与功能特性研究.pdf

摘要 本文主要利用碱溶酸法提取了柑橘和樱桃两种果仁粕蛋白，并分析了其功能特 性，包括乳化性、发泡性、溶解性、热稳定性等理化性质的研究。 我国柑橘年产量约1 0 0 0 万吨居世界第3 位。柑橘加工废料：果皮、肉渣、种 料约占果实重量的5 0 。在这些废料中橘籽占很大一部分，且其富含油脂和蛋白。 但由于国内柑橘加工业落后，综合利用程度低柑橘废料大部分被抛弃，造成资源浪 费，如果能将这部分废弃物进行加工，不但能缓解当前饲用蛋白的短缺，也能产生 很大的经济效益。目前国内还没有对橘籽蛋白进行研究，本课题作为野生果仁开发 利用的一部分，为橘籽的研究开发提供了理论依据。可以拉长柑橘生产的产业链， 缓解我国蛋白的供需矛盾，具有良好的应用前景，开展橘仁蛋白的生产应用研究， 实现工业化生产，并由此可产生明显的经济效益和社会效益。我们的工作如下： 本论文以药用橘籽仁为原料，提取了橘籽油后，分析了脱脂橘籽的主要成分， 橘籽的含仁率为8 0 6 ，粗蛋白为3 1 2 ，粗脂肪为4 4 2 ，粗纤维为0 0 5 5 3 ，灰 分为3 9 1 。利用碱溶酸沉法提取了橘籽中的蛋白，使用s o s p a g e 测定了橘籽蛋白 的亚基组成及其分子量，结果显示橘籽蛋白中含有7 种亚基，其中分子量为2 7 5 3 8 的亚基含量最高为5 4 9 9 6 。使用考马斯亮兰法测定了橘籽蛋白的溶解特性，得到其 s p i 值为3 0 。同时测定了p h 值对其溶解性的影响，在p h 值为4 0 的吸光度最小。 同时利用碱溶酸沉淀法精确测量出其等电点的p h 值为4 6 3 。研究了浓度和p h 值对 橘籽蛋白乳化性和乳化稳定性的影响，随着浓度的增加，其乳化性和稳定性都有增 大的趋势。在p h 值小于5 时，橘籽蛋白的乳化性和乳化稳定性随着p h 值的升高里 降低趋势；当p h 超过5 之后，随着p h 值的升高，其乳化性又略有升高；在p h = 5 左右时，其乳化性最小。其起泡性远远优于大豆蛋白，而p h 值对其泡沫稳定性的 影响不是很显著。 樱桃仁含蛋白率为2 9 左右。采用碱溶酸沉法对从樱桃仁中提取蛋白质的工艺 进行了研究，分别考察了碱液浓度、碱液温度、浸提时间和料液比对蛋白质提取率 的影响，在此基础上进行了正交试验，优化后的提取条件为p h = 9 5 ，浸提时间 郑州大学硕七学位论文 4 0 m i n ，温度4 0 ，料液比1 1 5 。使用s d s p a g e 测定了樱桃仁蛋白的亚基组成及 其分子量，结果显示樱桃仁蛋白中含有7 种亚基，其中分子量为1 8 6 9 4 的亚基含量 最高为4 1 8 。使用考马斯亮兰法测定了樱桃仁蛋白的溶解特性。同时测定了p h 值 对其溶解性的影响，发现在p h 值为4 o 的吸光度最大。同时利用碱溶酸沉法精确 测量出其等电点的p h 值为3 7 2 。测定了樱桃仁蛋白在不同浓度和p h 值条件下的乳 化性和起泡特性并与大豆蛋白进行了比较，中性时浓度对其乳化性的影响和大豆蛋 白比较相近，同一浓度下p h 值对二者的影响差别较大。其起泡性优于大豆蛋白， 而p h 值对其泡沫稳定性的影响不是很显著。 关键词橘籽樱桃仁成分 蛋白提取 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et a n g e r i n es e e d sa n dc h e r r y - k e r n e lp r o t e i nw e r ee x t r a c t e db ya l k a l ie x t r a c t i o n a n da c i dp r e c i p i t a t i o n , t h ea m i n oa c i da n dt h ef u n c t i o n a l i t yo f c h e r r y - k e r n e lp r o t e i nw e r e s t u d i e d ，i n c l u d i n ge m u l s i f y i n ga b i l i t y , f o a m i n ga b i l i t y , s o l u b i l i t ya n dt h e r m a ls t a b i l i t y w e r ei n v e s t i g a t e da sw e l l u s i n gm e d i c i n a lt a n g e r i n es e e da sm a t e r i a l ，t h em a i nc o m p o n e n t so fd e f a t e d t a n g e r i n es e e dw e r ea n a l y z e d ：f r u i tn u t l e tc o n t e n t8 0 6 ，c r u d ep r o t e i n3 1 2 。c r u d e l i p i d4 4 2 ，c r u d ef i b r eo 0 5 5 3 ，a s hc o n t e n t3 9 1 p r o t e i n sw c i ee x t r a c t e df r o m d e f a t e dt a n g e r i n es e e dt h r o u g ha l k a l ie x t r a c t i o na n da c i dp r e c i p i t a t i o nm e t h o d t h e s u b u n i tc o m p o s i t i o na n dt h e i rm o l e c u l a rw e i g h tw e r em e a s u r eu s i n gs d s - p a g e t h e r e s u l ts h o w e dt h e r ea r e7k i n d so fs u b u n i ti nt h et a n g e r i n es e e d t h es u b u n i t ，m o l e c u l a r w e i g h to f w h i c h i s2 7 5 3 8 ，i so f t h eh i g h e s tc o n t e n t ( 5 4 9 ) t h es o l u b i l i t yo f t a n g e f i n e p r o t e i nw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gc o o m a s s i el i g h tb l u em e t h o d t h es p iv a l u eo f w h i c hi s 3 0 m e a n w h i l e ，t h ee f f e c to fp ho nt h es o l u b i l i t yw a ss t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h e a b s o r b a n c ei sm i n i m a lw h e np hi sa t3 5 i t si s o e l e c t r i ep o i n tw a se s t a b l i s h e de x a c t l ya s 4 6 3u s i n ga l k a l i s o l u t i o na n da c i d i s o l a t i o nm e t h o d t h ee f f e c t so fc o n c e n t r a t i o na n d p ho nt h ee m u l s i l y i n gp r o p e r t ya n de m u l s i f y i n gs t a b i l i t yw e r ei n v e s t i g a t e d w i t ht h e i n c r e a s i n go fc o n c e n t r a t i o n e m u l s i f y i n gp r o p e r t ya n de m u l s i f y i n gs t a b i l i t yb o t l li n c r e a s e a sw e l l w h e nt h ep hv a l u ei sb e l o w5 ，e m u l s i f y i n gp r o p e r t ya n de m u l s i f y i n gs t a b i l i t y r e d u c e dw i t l lt h ei n c r e a s eo fp h b u tw h e np hi sa b o v e5 e m u l s i f y i n gp r o p e r t yi n c r e a s e al i t t l ea sp hi n c r e a s e d a tp h5 ，e m u l s i f y i n gp r o p e r t yi sw o r s t t h ef o a m i n ga b i l i t yo f t a n g e r i n ep r o t e i ni ss u p e r i o rt os o y b e a np r o t e i n t h ee f f e c to f p h o nt h ef o a m i n gs t a b i l i t y i sn o ts i g n i f i c a n t c h e r r y k e r n e lp r o t e i na c c o u n t sf o r2 9 8 1 o fc h e r r y - k e m e l t h ec h e r r y k e r n e l p r o t e i nw a se x t r a c t e db ya l k a l i e x t r a c t i o na n da c i dp r e c i p i t a t i o n t h ei n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o n o fn a o h ，e x t r a c t i o nt i m ea n dt h er a t i oo fw e i g h to f c h e r r y k e r n e lt ov o l u m eo fs o l v e n tw e r es t u d i e d t h er e s u l t so b t a i n e ds h o w e dt h a tt h e i i i 郑州大学硕士学位论文 o p t i m a lc o n d i t i o n sw e r e - p h9 5 ，e x t r a c t i o nt i m e4 0 m i n ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 ( 3a n d t h er a t i oo fm a t e r i a lt os o l v e n t1 ：1 5 ( w v ) t h es u b u n i t sa n dt h ec o n t e n to fs u b u n i t so f c h e r r y - k e r n e lp r o t e i nw e f ed e t e r m i n e db yu s i n gs d s p a g e n 圮r e s u l t ss h o w e dt h e p r o t e i no fc h e r r y - k e r n e li sf o r m e do fs e v e ns u b u n i t s ，t h ec o n t e n to ft h es u b u n i tw h o s e m o l e c u l a rw e i g h ta r e18 6 9 4i s4 1 8 t h r o u g ha n a l y z i n gt h es o l u b i l i t yo fc h e r r y - k e r n e l r e s u l ts h o w e dw h e np hi s4 0t h es o l u b i l i t yo f c h e r r y k e r n e li sh i g h e s t t h ee x p l o i t a t i o n t e s t st h ed e l i q u e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i ct h a tt h em e t h o do fm a 3s il i a n g 4m e a s u r e st h e c h e r r y 。k e r n e lp r o t e i n t h er e s e a r c hs t u d i e dt h ee m u l s i f y i n ga b i l i t ya n df o a m i n ga b i l i t y , a n d c o m p a r e dw i ms o y b e a r lp r o t e i n , t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ei s1 1 0d i f f e r e n c eb e t w e e n t h ee m u l s i f y i n ga b i l i t yo fc h e r r y - k e r n e lp r o t e i na n ds o y b e a np r o t e i na n dt h ef o a m i n g a b i l i t yo f c h e r r y - k e r n e li sb e t t e rt h a nt h a to f s o y b e a np r o t e i n k e yw o r d s ：t a n g e r i n es e e d sc h e r r y k e r n e lm p o s i t i o n p r o t e i ne x t r a c t i o n 郑州大学硕士学位论文 1 1 蛋白质 1 1 1 蛋白质的功能性质m 第一章前言 生命科学已成为自然科学之首，举世瞩目。而生命科学中最重要的研究对象是脱 氧核糖核酸和蛋白质。前者组成染色体及染色体上的基因，传递遗传密码，记载生物 信息，是生物的指挥部。后者是基因表达的产物，参与生物体内的每一步反应和活动。 没有蛋白质的参与，即使是最简单的活动，生物都无法进行。蛋白质是维持人类生命 的第一营养素，是人体组成及代谢的物质基础，也是人类饮食结构的重要成分，添加 到食品中可以有效地提高产品的营养价值，更重要的是蛋白质在食品中可以体现出不 同的功能特性，影响食品的感官特性。因此蛋白质广泛用于食品加工的各个领域。 蛋白质的功能性质主要分三类：( 1 ) 水化性质，包括水吸收及保留、湿润性、溶 胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肽键骨架上的极性基团与水分子发生 水化作用。( 2 ) 与蛋白质一蛋白质相互作用有关的性质，包括产生沉淀作用、凝胶作 用和形成各种其它结构( 如蛋白质面团和纤维) 。蛋白质分子受热舒展，内部的疏水 基团暴露出来，通过疏水作用( 高温能提高此类作用) 、静电作用( 通过c a 2 和其它 二价离子桥接的) 、氢键( 冷却能提高此类作用) 或二硫交联形成空间网状结构。( 3 ) 表面活性，包括表面张力、乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基又有亲油 基，能够吸附在油一水或空气一水界面上，一旦被界吸附，蛋白质形成一层膜，可阻 止小液滴或气泡凝聚，有助于稳定乳化液和气泡。这些功能特性在食品中常被应用。 蛋白质的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成、排列顺序、构想、分子的形状 和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用。一般蛋白质仅含有各种氨基酸，但 有些蛋白质，除氨基酸外，还含有其它成分，称之为结合蛋白质。蛋白质的分子量一 般在1 0 4 至1 0 6 道尔顿之间，小的如细胞色素c ，由1 0 4 个氨基酸组成，大的则含有 8 3 0 0 个氨基酸残基。蛋白质共有四级结构。氨基酸的排列顺序是第一结构；由局部 形成的a 一螺旋体和1 3 一折叠片是其第二级结构；此外，蛋白质内部通过离子力、氢键、 二硫键、憎水力和偶极作用力等，形成三维空间构型，是第三机构；各种蛋白质亚基 第一章前言 组合起来则形成第四级结构。 在一个普通的细胞中有几千种蛋白质，每种蛋白质执行特殊的功能。蛋白质对生 物体的作用非常重要。在成人体内大约有六十万亿个细胞，几乎发生在细胞内部的每 一个过程都涉及到一种或者多种蛋白质即使一种蛋白质不工作也不会引起疾病。蛋 白质具有以下生物功能： ( 1 ) 酶。几乎细胞体内的所有生物化学反应都需要酶来催化。在不同的生物体 内发现了几千种酶，每种酶催化一种化学反应。从下列事实可看出酶的重要性：很多 化学反应都需要在特殊的p h 值、高温、高压和高反应物浓度完成，而我们人体的p h 值呈中性，生活在大气压中，体温是3 7 c ，人类不可能通过改变上述条件来加快体 内化学反应过程；火车的燃烧热能量转化率只有8 ，而细胞中线粒体内能量的转化 率高达5 0 。因此，所有的生物体都需要依赖酶的活力。其作用是把底物结合在一起。 稳定其过滤态，改变反应历程，导致生成产物。 ( 2 ) 传输和贮存蛋白质。有些蛋白质传输和贮存如金属离子、氧气、葡萄糖和 酯类等在生化上非常重要的物质。以血红蛋白为例，这种蛋白质的作用就是传送氧气。 它是由两个n 链和两个b 链组成。血液经肺部时它与氧气结合；当血液流到体内各器 官时则将其中的氧气释放出来( 氧气参与葡萄糖和其它营养成分的氧化反应，产生能 量) ，顺便把二氧化碳带回肺部。 ( 3 ) 运动和结构蛋白质。有些蛋白质使细胞或组织产生收缩，改变形状。例如， 肌动蛋白和肌球蛋白控制骨架周围肌岗的收缩。很多蛋白质用来增强生物体的强度或 起保护作用，如头发、指甲等大多由坚硬和不溶的角蛋白质组成。 ( 4 ) 防御蛋白质。很多蛋白质用来抵抗外来物的入侵或者防御损伤。如免疫球 蛋白或者抗体能识别、沉淀或者中和入侵细菌和病毒，它们能与外来物结合，或者包 围外来物，使其失活。 ( 5 ) 调节蛋白质。很多蛋白质能帮助调节细胞活性或者其生理功能，其中很多 是激素。其它的调节蛋白质与脱氧核糖核酸键合在一起，调节酶和核糖核酸的生物生 成。 2 郑州大学硕+ 学1 1 ：) = 论文 i i 2 蛋白质提取与纯化技术 以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物 学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。 一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或 几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等：二是将混合物置于单一物相中， 通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心， 超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物象只限于固相和液相，并 在这两相间相互交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶 解度等主要因素进行分类。按分子大小和形状分为差速离心、超滤、分子筛及透析等 方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差 异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层系等：按生物功能专一性 有亲和层析法等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止 酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分 为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及分离，提取和纯化，浓细、干燥 和保存。棚 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实 验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸 的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：( i ) 利用微生物菌体 分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；( 2 ) 利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、 核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同， 其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择 有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理 好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材 料制各。 1 ) 蛋白质( 包括酶) 的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶 于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及 3 第一章前言 酶。 ( 1 ) 水溶液提取法 4 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的 溶剂，通常用量是原材料体积的卜5 倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶 解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升 高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白 质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5 以下) 操 作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂( 如二异丙基氟磷 酸，碘乙酸等) 。 a p h 值 蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的p h 值应选择在偏离等电点两 侧的范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生 变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液 提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 b 盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部 分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量n a c l 等中性盐， 一般以0 1 5 m 为宜。缓冲液常采用0 0 2 0 0 5 m 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 ( 2 ) 有机溶剂提取法”1 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀 盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性， 还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法 对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是 溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。 另外，丁醇提取法的p h 值及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 4 郑州大学硕士学位论文 2 ) 蛋白质的分离纯化嗍 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： ( 1 ) 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 a 蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白 质的溶解度增加，称为盐溶：当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并 先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子( 如硫酸 铵的s 仉和n 也) 有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是 蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液p h 在蛋白质等电点则效果更好。由于各 种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混 合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：一是温度：除对温度敏感的蛋白质在低温( 4 ) 操作外， 一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质( 如血红蛋白、 肌红蛋白、清蛋白) 在较高的温度( 2 5 c ) 比o c 时溶解度低，更容易盐析。二是p h 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。三是蛋白质浓度：蛋白质 浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来( 共沉现象) 。因 此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2 5 3 o 。蛋白质盐析常 用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的 硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大( 2 5 c 时饱和溶液为4 1 m ，即7 6 7 克升； o c 时饱和溶解度为3 9 m ，即6 7 6 克升) ，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都 可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性a 硫酸 铵溶液的p h 值常在4 5 5 5 之间，当用其他p h 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即 把蛋白质溶液装入透析袋内( 常用的是玻璃纸) ，用缓冲液进行透析，并不断的更换 缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶g 一2 5 或g - 5 0 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 第一章前言 b 等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质 的等电点有差别，可利用调节溶液的p h 值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此 法很少单独使用，可与盐析法结合用。 c 低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析 出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 ( 2 ) 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 a 透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心 力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的 半透膜截留不同分子量的蛋白质。 b 凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的 方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶( s e p h a d e x g e d ) 和琼脂糖凝胶 ( a g a r o s eg e l ) ( 3 ) 根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同p h 值环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 a 电泳法 各种蛋白质在同一p h 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不 同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电 泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的p h 梯度，当带一定电荷的蛋白质 在其中泳动时，到达各自等电点的p h 值位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋 6 郑州大学硕士学位论文 自质。 b 离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂( 如：羧甲基纤维素；0 4 - 纤维素) 和阴离子交换剂 ( - - 7 , 氨基乙基纤维素；l a n g = z h - c n 纤维素) 。当被分离的蛋白质溶液流经离子交 换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改 变p h 值或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 ( 4 ) 根据配体特异性的分离方法一亲和层析法 亲和层析法( a f l i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ) 是分离蛋白质的一种极为有效的方法， 它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分 离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体( l i g a n d ) 的 分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离 ( s e p a r a t i o n ) ，提纯( p u r i f i c a t i o n ) 和鉴定( c h a r a c t e r i z a t i o n ) 是生物化学中 的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的 混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 细胞的破碎：( 1 ) 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约l 3 体 积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适 用于动物内脏组织、植物肉质种子等。( 2 ) 玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管 中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组 织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。( 3 ) 超声波处理法：用一定功率的超声 波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备 各种酶，常选用5 0 - 1 0 0 毫克菌体毫升浓度，在i k g 至i o k g 频率下处理1 0 一1 5 分钟， 此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核 酸应慎用。( 4 ) 反复冻融法：将细胞在- 2 0 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于 细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。( 5 ) 化学处 理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠( s d s ) 、去氧胆酸钠等细 胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 7 第一章前言 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液 中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸( d f p ) 可以 抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的 活性，加入苯甲磺酰氟化物( p m s f ) 也能清除蛋白水解活力，但不是全部，还可通过 选择p h 、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 3 ) 浓缩、干燥及保存 ( 1 ) 样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目 的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的： & 减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸 发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分予的浓缩。 b 空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发，铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生 物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不断蒸发， 而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。 c 冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时 先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的 差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白 质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得 蛋白质和酶的浓缩液。 d 吸收法 通过吸收剂直接除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不起化 s 郑州大学硕士学位论文 学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡 咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋 里，外加聚乙二醇覆盖置于4 下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇 被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。 e 超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，液 体在一定压力下( 氮气压或真空泵压) 通过膜时，溶剂和小分予透过，大分子受阻保 留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱 盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率 高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量 截止值( 即大体上能被膜保留分子最小分子量值) 等参数均不同，必须根据工作需要 来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影 响。 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低 离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋 白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。 这就是纤维过滤透析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短1 0 倍。 ( 2 ) 干燥 生物大分子制备得到产品。为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的 方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存， 整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力 下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般 先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体 而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生 物大分子的干燥保存。 ( 3 ) 贮存 9 第一章前言 生物大分子的稳定性与保存方法有很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温 情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于 干燥器内( 内装有干燥剂) 密封，保持o 一4 冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几 点。 a 样品不能太稀。必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分 子变性。 b 一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚 等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶 以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分 子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。 c 贮藏温度要求低，大多数在o c 左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同 物质而定。 1 1 3 等电点 蛋白质是由一系列氨基酸通过肽键组成的，尽管在蛋白质内部氨基酸的a 羟基与 a _ 氨基的电离性在形成肽键时已消除，但天门冬氨酸与谷氨酸的支链羧基，赖氨酸与 精氨酸残基的氨基仍可电离，使得蛋白质分子所带静电荷可随环境的p h 值而变化； p h 值较低时，碱性氨基酸的支链功能基及酸性氨基酸的羧基质子化，使蛋白质带正 电荷；p h 值较高时，质子的碱性与酸性功能被移除，蛋白质带负电荷；因此说蛋白 质和氨基酸一样是两性电勰质，是带有正负两种电荷的胶体大分子物质，蛋白质分子 的解离状态和解离程度受溶液酸碱度的影响，当溶液的p h 值达到一定数值时，蛋白 质颗粒上正负电荷相等，蛋白质呈现电中性，此时既不向阴极移动，也不向阳极移动， 即净电荷为0 时的p h 值称之为等电点( p i ) 。在等电点时，蛋白质的导电性、溶解性、 粘度、渗透压皆最小，但其胶体溶液的稳定性最差，沉淀量最大i “。 1 2 橘籽蛋白的功能特性 橘又名扁柑，为芸香科( r u t a c e a e ) 柑橘属( c i t r u sl ) 植物”，长绿小乔木或灌 木，高约3 米，高小枝较细弱，无毛，通常有刺，叶长卵状披针形，长4 8 c m ，花 1 0 郑州大学硕士学位论文 黄白色，单生或簇生叶腋，果扁球形，径5 7 c m ，橙黄色或橙红色，果皮薄易剥离， 春季开花，1 0 1 2 月果熟，性喜温暖湿润气候，耐寒性较柚、酸橙、甜橙稍强。主 要产于四川、广东、浙江、福建、江苏、湖南、贵州等省。 我国是世界上最早栽培柑橘的国家，已经有4 0 0 0 年以上的历史，禹贡记载夏 禹时已贡楠柚：周礼东官考工记有“橘逾淮北而为枳，此地气然也。” c b d ，即温 度影响最大，其次为碱液浓度，浸提时间和料液比的影响最小。综合各因素作用。得 出碱溶法的最佳浸提条件是a 。b 2 c ：d 。，即在p h 为9 5 的碱液中，按照1 ：1 5 的料液比， 在4 0 ( 2 条件下搅拌浸提4 0 m i n ，蛋白质提取率达到9 4 1 5 。 4 2 6 验证实验 称取1 0 9 原料在正交实验确定的优化条件：即在p h 为9 5 的碱液中，按照1 ： 1 5 的料液比，在4 0 c 条件下搅拌浸提4 0 m i n ，进行碱溶法提取樱桃仁蛋白实验( n = 5 ) 。实验结果见表4 - 4 。 4 3 第四章樱桃仁蛋白的提取丁艺与功能特性 表4 - 4 樱桃仁蛋白提取率测定结果( n = 5 ) 提取率，平均值 r s d 9 4 1 6 9 3 7 7 9 4 1 59 4 o oo 5 2 9 4 5 8 9 3 1 8 由表4 4 可知，在该优化条件下平均一次提取率为9 4 0 0 。验证实验结果和正 交实验结果相符，且提取率结果较为稳定，说明工艺可行。 4 3 樱桃仁蛋白等电点 不同植物蛋白质各有其特定的等电点，然而在天然状态下，植物蛋白质在溶液中 保持稳定的亲水胶体状态，其原因有二：其一为水化作用，即蛋白质分子表面附有能 有效防止蛋白质分子沉淀析出的一层水化层；其二是电荷排斥作用，即蛋白质分子周 围除水化膜外还有电荷层，能有效防止蛋白质分子的凝聚。 本试验在测定樱桃仁蛋白等电点时，为了更有效，更准确地得到其等电点，首先， 从p h 值2 - 7 设置了1 1 个点，以便了解其大致的范围，为下一步连续细化等距的p h 沉淀试验做准备。测得的结果如下图4 5 所示： o 6 5 0 5 5 沉 淀0 4 5 量o 3 5 g 0 2 5 o 1 5 0 0 5 1 02 03 o4 0 5 06 07 08 0 p h 图4 - 5p h 值对樱桃仁蛋白沉淀量的影响 4 4 郑州大学硕+ 学位论文 由图4 5 可明显的看出在p h 值为3 5 附近蛋白沉淀量明显增多，因此在其附近 做连续化的蛋白沉淀试验。结果如图4 - 6 所示。 0 6 5 o 6 0 沉o 5 5 鋈o 5 0 “0 4 5 g 一0 4 0 0 3 5 0 3 0 1 52 02 53 03 54 04 55 0 p h 图4 - 6p h 值对樱桃蛋白沉淀量的影响 由图4 - 6 知在p h 值为3 7 4 时沉淀量最大，这一结果与大豆蛋白的等电点比较接 近，因此说明樱桃仁蛋白与大豆蛋白在组织和结构上有一些相似之处。除此之外在 p h 值为3 7 4 附近设8 个点以便了解等电点的确切数值，测量结果如表4 5 所示： 表4 - 5 樱桃仁蛋白沉淀量( g ) 与p h 值的关系 p h 值3 7 13 7 23 7 33 7 43 7 53 7 6 3 7 73 7 8 i 沉淀量 0 5 9 1 10 5 9 3 40 5 9 2 20 5 9 0 10 5 8 8 60 5 8 8 00 4 9 9 6 0 4 9 9 1 从表4 - 5 可以看出樱桃仁蛋白在p h 值为3 7 2 时沉淀量最大，因此我们认为樱桃 仁蛋白的等电点为3 7 2 。 4 4 樱桃仁蛋白分子量 s d s p a g e 是测定蛋白质分子量的一种方法。在过量s d s 和巯基试剂( 裂解二硫 健) 的存在下，将蛋白质混合物加热至1 0 0 c 变性，此时，大多数多肽以恒定的比例 与s d s 结合。s d s 与蛋白质的结合带来了两个后果：第一，由于s d s 是阴离子，使多 肽链覆盖上相同密度的负电荷，使电荷量远超过蛋白分子原有的电荷量，结果使所有 的s d s 一蛋白质复合物电泳时都以相同的电荷蛋白质比向正极移动。第二，改变蛋白 第四章樱桃f 蛋白的提取r 艺与功能特性 质单体分子的构象，使不同蛋白质复合物的短轴长度一致，而长轴长度则与分子量成 正比，所以多肽分子在适当的孔径凝胶中严格按照分子的大小泳动。 采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 测定了蛋白质亚基组成 及分子量范围。脱脂樱桃仁蛋白经过样品缓冲液加热处理后进行电泳分析，测得电泳 图谱如图4 - 7 所示。 图4 - 7 樱桃仁蛋白电泳分析 表4 6s d s - p a g e 图谱及分析 1234567 分子量( d ) 7 1 6 9 15 3 9 8 64 3 2 4 0 2 7 8 5 3 2 3 9 2 31 8 6 9 4 1 5 4 1 0 百分含量( ) 4 0 2 9 92 1 45 o 1 5 14 1 82 8 由表4 - 6 可知，分子量为1 8 6 9 4 左右的蛋白质亚基含量最高，占总含量的4 1 8 ， 分子量为7 1 6 9 1 亚基含量也较高，占4 0 2 以上，二者是樱桃仁蛋白中的主要亚基。 郑州大学硕士学位论文 4 5 樱桃仁蛋白功能特性 4 5 i 樱桃仁蛋白中水溶性蛋白质的含量 水溶性是蛋白质的重要功能特性，水溶性直接影响着蛋白的乳化性、胶凝性、起 泡性等，决定着蛋白质在食品加工中的稳定性、风味等。蛋白质的溶解性受加工条件 的影响很大，特别是加工过程中的热变性可大大降低其溶解性。同时，蛋白质的溶解 性还与p h 值、温度、离子强度有着密切的关系。 o 0 5 0 0 4 0 0 3 a0 0 2 o 0 1 o 一0 0 1 0 20 4 0 60 8i1 2 c ( m g m 1 ) 图4 - 8 牛血清的蛋白含量与吸光度标准曲线 由图4 - 8 可知，溶液中蛋白质含量和吸光度呈线性关系( a = o 0 4 8 c ) 。经测定樱 桃仁蛋白溶液的吸光度为0 0 3 6 则根据上述曲线可知樱桃仁蛋白水溶液中蛋白质浓 度为0 7 5 m g m k ，由此可计算出樱桃仁蛋白中水溶性蛋白含量为2 2 5 。 4 5 2 樱桃仁蛋白的起泡性 起泡性是指蛋白质搅打起泡的能力，泡沫稳定性是指泡沫保持稳定的能力，蛋白 质的起泡性和泡沫稳定性与溶液p h 值、浓度、离子浓度、热处理、蛋白